王 鑫，徐麗萍

（哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院省高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱150076）

大豆低聚肽是大豆蛋白經(jīng)酶解作用處理后得到的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，除氨基酸組成與大豆蛋白一樣具有優(yōu)質(zhì)蛋白的特點以外，還具有大豆蛋白所不具備的良好的溶解性、穩(wěn)定性等理化性質(zhì)，而且具有易吸收和低過敏原性、降低血脂和膽固醇、降低血壓、促進礦物質(zhì)吸收和脂肪代謝、增強運動員體能等多種生理功能[1]。隨著生物技術(shù)的進步和生命科學的發(fā)展，大豆肽的生理功能逐步被人們發(fā)現(xiàn)，一些活性肽的結(jié)構(gòu)和生理功能逐漸明確，推動了活性肽的研究，也促進了大豆肽的研究與開發(fā)。美國在70年代初研制出大豆肽產(chǎn)品，建成了年產(chǎn)5000t食用大豆肽的工廠。日本于80年代開展此方面的研究，雪印和森永等乳業(yè)公司均已成功地將大豆肽應用于食品工業(yè)中[2]。但此時他們生產(chǎn)的大豆低聚肽也多用酸解法、堿解法和氫解法，這樣生產(chǎn)的肽化學物質(zhì)難以除盡、苦味重[3]。我國對于大豆低聚肽的研究開發(fā)起步較晚，于80年代中后期才開始興起，基礎和應用研究都很薄弱，目前仍處于起步階段。有研究表明，大豆分離蛋白酶解物具有清除羥自由基的能力，清除能力主要與暴露的氨基酸側(cè)鏈基團和肽序列有關(guān)[4]。大豆低聚肽能夠及時修復運動過程中損傷的骨骼肌細胞，維持骨骼肌細胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性。同時，能夠增加睪酮的分泌，促進蛋白質(zhì)合成。其抗疲勞機制可能通過提高肝糖原的儲備、降低血乳酸含量，通過增強SOD活性，抑制氧自由基的釋放及提高免疫功能發(fā)揮抗疲勞作用。人體實驗證實，大豆低聚肽能夠有助于減輕運動后疲勞[5]。

通過實驗探討大豆低聚肽對小鼠的抗疲勞及抗氧化作用，為新型營養(yǎng)補劑的開發(fā)提供理論依據(jù)和實驗基礎。對有效利用我國豐富的大豆資源，提高大豆的利用價值，并向高強度運動員提供新型健康的抗疲勞保健食品具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆低聚肽 自制；紐崔萊蛋白粉 成都安利日用品有限公司；小鼠 體重18～22g，6～8周齡、基礎飼料 哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物室；總抗氧化能力測定試劑盒、抗超氧陰離子自由基測試盒、血尿素氮測試盒、肌糖原及肝糖原測定試劑盒 南京建成科技有限公司；水楊酸 天津市泰興化學試劑有限公司；亞油酸 上海市精細化學品研究所；硫代巴比妥酸 國藥集團化學試劑有限公司。

TGL-16G型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；FSH-2型可調(diào)高速勻漿器，微量移液器 上海安亭微量進樣器廠；TU-1900型紫外分光光度計 北京普析通用有限公司。

1.2 實驗方法

準確稱量25g大豆分離蛋白，木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶按2∶1的比例加入1g，用蒸餾水溶解，攪拌混勻，然后定容到500m L，將溶液調(diào)至pH為7，于55℃水溶液中酶解2h，取濾液濃縮冷凍干燥后為大豆低聚肽，待用于小鼠的灌胃。

1.2.1 動物的分組及喂養(yǎng) 取40只小白鼠隨機分為5個組，每組8只，雌雄各半。5個實驗組分別為：陰性對照組（CG）蒸餾水灌胃，3個劑量組大豆低聚肽溶液灌胃，其劑量分別為2.0g/kg（LD）、4.0g/kg（MD）、8.0g/kg（HD）；陽性對照組（WPC）紐崔萊蛋白溶液灌胃，劑量為4.0g/kg[6]。采用灌胃法，每天給小鼠灌胃不同劑量的受試物，對照組給予同等體積的蒸餾水灌胃，每天一次，小鼠自由攝食鼠糧與飲水，連續(xù)15d[7]。然后進行各項抗疲勞指標的測定。

1.2.2 大豆低聚肽抗氧化活性的研究

1.2.2.1 總抗氧化能力測定 配制不同濃度的大豆低聚肽及VC溶液，并按照總抗氧化能力測定試劑盒的說明書嚴格要求操作。

定義：在37℃時，每分鐘每毫升樣品使反應體系的吸光值每增加0.01時為一個總抗氧化能力單位。

總抗氧化能力（單位/毫升樣品）=（測定管吸光度-對照管吸光度）/（0.01×30）×（反應液總體積/取樣量）×樣品測試前的稀釋倍數(shù)

1.2.2.2 抑制超氧陰離子自由基能力測定 按照超氧陰離子自由基及產(chǎn)生超氧陰離子自由基測定試劑盒說明書嚴格要求操作。

定義：在反應系統(tǒng)中，每升樣品在37℃反應40m in所抑制的超氧自由基相當于1mg的維生素C所抑制的超氧陰離子自由基的變化為一個活力單位。

式中：Ai—對照管吸光度；AS—測定管吸光度；Aj—標準管吸光度；C—標準管濃度（0.15mg/m L）；V—1000m L；n—樣品測試前稀釋倍數(shù)。

1.2.2.3 抑制羥自由基能力測定 在25m L容量瓶中依次加入2mmol/L FeSO43m L、1mmol/L H2O23m L，搖勻，接著加入6mmol/L水楊酸3m L，加入蒸餾水補充至25m L，搖勻，于37℃水浴加熱60m in后取出，測其吸光度A0。分別加入1mg/m L大豆低聚肽溶液及VC溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0m L于25m L容量瓶中，同樣加入2mmol/L FeSO43m L、1mmol/L H2O23m L，搖勻，接著加入6mmol/L水楊酸3m L，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，水浴加熱60m in，取出測其吸光度Ai。按式（2）計算待測液清除率，待測液對羥自由基（·OH）清除率為：

式中：A1—加樣液時溶液的吸光度；A0—不加樣液時溶液的吸光度。

1.2.2.4 抑制烷自由基能力測定 分別準確吸取1mg/m L大豆低聚肽溶液及VC溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0m L與0.1m L亞油酸混合，加入5m L乙醇，5m L 0.1mol/L磷酸緩沖液（pH=8.0）、用10W紫外燈的紫外光照射120m in。然后加入4m L 20%三氯乙酸（W/V）、1m L 3%硫代巴比妥酸（W/V），95℃水浴反應90min，冰浴冷卻，離心，于532nm處比色，A0為以蒸餾水代替試樣作為空白組的吸光度。根據(jù)式（3）計算清除率，待測液對烷基自由基（ROO·）清除率為：

式中：A1—加樣液時溶液的吸光度；A0—不加樣液時溶液的吸光度。

1.2.3 大豆低聚肽抗疲勞作用的研究

1.2.3.1 力竭游泳時間的測定 連續(xù)灌胃15d，末次灌胃30m in后，將小鼠置于游泳箱中游泳。水深約25cm，水溫（25±1.0）℃，鼠尾根部負荷5%體重的鉛皮[4]。記錄小鼠自游泳開始至力竭的時間（以鼻孔下沉為判斷標準），作為小鼠力竭游泳時間[8]。

1.2.3.2 血漿尿素氮（BUN）含量的測定 連續(xù)灌胃15d，末次給小鼠灌胃后，次日，在溫度為25℃的水中不負重游泳30m in。運動后休息15m in后立即斷頭采血0.2m L，用肝素來對血漿進行抗凝。采血后完畢，立即2000r/min離心15min，取血清20μL并于520nm波長比色，測定血漿尿素值，計算血漿尿素氮含量（測定方法及尿素氮含量計算公式詳見血尿素氮試劑盒）[9]。

1.2.3.3 肝糖原含量的測定 連續(xù)灌胃15d，末次給小鼠灌胃后，次日，在溫度為25℃的水中不負重游泳30m in。運動后休息15m in后立即處死，取肝臟經(jīng)生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，精確稱取肝臟100mg，將肝臟與堿液按1∶3加入試管后進行勻漿制成水解液，并置于沸水浴中20min，流水冷卻，將肝糖原水解液配制成1%檢測液，同時配制空白與標準溶液，混勻，沸水浴5m in，冷卻，于620nm波長比色，計算肝糖原含量（測定方法及肝糖原含量計算公式詳見肝糖原含量測定試劑盒）。

1.2.3.4 肌糖原含量的測定 連續(xù)灌胃15d，末次給小鼠灌胃后，次日，在溫度為25℃的水中不負重游泳30m in。運動后休息15m in后立即處死，取股四頭肌經(jīng)生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，精確稱取股四頭肌100mg，將肌肉與堿液按1∶3加入試管后進行勻漿制成水解液，并置于沸水浴中20min，流水冷卻，將肝肌糖原水解液配制成5%檢測液，同時配制空白與標準溶液，混勻，沸水浴5m in，冷卻，于620nm波長比色，計算肌糖原含量（測定方法及肝糖原含量計算公式詳見肌糖原含量測定試劑盒）。

2 結(jié)果與討論

2.1 動物的分組及喂養(yǎng)結(jié)果分析

對小鼠進行連續(xù)灌胃15d后，陰性、陽性對照組和大豆低聚肽的高、中、低劑量組小鼠體重差異結(jié)果見表1。

表1 實驗過程對小鼠生長發(fā)育的影響Table1 The effectof the experiments onmice growth

由表1可知，小鼠在喂養(yǎng)15d后體重均表現(xiàn)出增長的趨勢。說明高脂飼料能夠?qū)е滦∈篌w重明顯增加，飼料誘導高血脂大鼠模型制備成功。

2.2 大豆低聚肽抗氧化活性的研究結(jié)果分析

2.2.1 大豆低聚肽總抗氧化能力測定結(jié)果分析 由圖1可知，大豆低聚肽顯現(xiàn)出一定的抗氧化能力，隨著大豆低聚肽的濃度增大，總抗氧化能力越強，但低于參比VC的抗氧化能力。因此，在該實驗中，大豆低聚肽總抗氧化能力最大為13.86U/m L。

圖1 總抗氧化能力測定Fig.1 Determination of total antioxidant capacity

2.2.2 大豆低聚肽抗超氧陰離子能力測定結(jié)果分析

由圖2可知，不同濃度的大豆低聚肽對超氧陰離子的產(chǎn)生都有一定的清除作用，且隨著大豆低聚肽濃度的增加，抗超氧陰離子自由基的效果增強。O·是活性氧的一種，是機體壽命最長的自由基，通常作為自由基鏈式反應的引發(fā)劑，產(chǎn)生活性更強的·OH自由基，進一步給機體造成危害?？梢姶蠖沟途垭膶·有一定的清除作用。因此，在該實驗中，大豆低聚肽抗超氧陰離子自由基能力最大為158.67U/L。

圖2 抗超氧陰離子自由基能力的測定Fig.2 Determination of superoxide anion radical scavenging

2.2.3 大豆低聚肽對羥自由基清除效果的結(jié)果分析

由圖3可知，隨著大豆低聚肽濃度的升高，其對羥自由基的清除率逐漸升高，但是變化不明顯；VC對羥自由基的清除率同樣隨著濃度升高而升高，但當加入大于2m L VC時，其清除率就已達到100%；在0.5～2.0m L范圍內(nèi)，VC的清除率約為大豆低聚肽的10倍，因此說明了大豆低聚肽對羥自由基具有一定的抗氧化效果。因此，在該實驗中，大豆低聚肽抗超氧對羥自由基的最大抑制率為17.11%。

圖3 羥自由基能力測定Fig.3 Determination of hydroxyl radical

圖4 清除烷基自由基能力測定Fig.4 Determination of alkyl radicals capability

2.2.4 大豆低聚肽對烷基自由基清除效果的結(jié)果分析 由圖4可知，隨著大豆低聚肽濃度的升高，其對烷基自由基的清除率逐漸升高，變化趨勢明顯，但略低于參比VC清除率。因此說明了大豆低聚肽具有和VC相當?shù)目寡趸Ч?。在該實驗中，大豆低聚肽抗超氧對對烷基自由基的最大抑制率?1.97%。

2.3 大豆低聚肽抗疲勞作用研究結(jié)果分析

2.3.1 大豆低聚肽對小鼠力竭游泳時間的結(jié)果分析

由圖5可知，力竭游泳時間最長的為高劑量組（45.51± 1.39）m in，最短的為陰性對照組（33.76±2.68）m in；三個劑量組和陽性對照組的力竭游泳時間明顯高于陰性對照組，并且差異顯著（p＜0.05）；中、高劑量組之間差異不顯著。力竭游泳測試是常用的抗疲勞測試方法[10]。疲勞是機體活動到達一定程度后產(chǎn)生的一種自我保護的生理機制，可以防止威脅生命的過度機能衰竭，而力竭游泳時間可以最直觀地體現(xiàn)受試物的抗疲勞功效[11]。在宏觀上體現(xiàn)出大豆低聚肽良好的抗疲勞效果。

圖5 大豆低聚肽對各組小鼠游泳時間的影響Fig.5 The effectof soybean oligopeptides on swimming time for each group ofmice

圖6 大豆低聚肽對各組小鼠BUN含量的影響Fig.6 The effect of soybean oligopeptides on BUN levels for each group ofmice

2.3.2 大豆低聚肽對小鼠BUN含量的結(jié)果分析 由圖6可知，在小鼠力竭游泳之后，BUN含量最高的為陰性對照組（18.15±0.38）mmol/L，含量最低的為高劑量組（17.05±0.33）mmol/L；灌喂大豆低聚肽的劑量組和陽性對照組的BUN含量均低于陰性對照組；并且劑量組的BUN含量有降低趨勢。BUN是體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的最終產(chǎn)物，主要在肝細胞中生成。對運動時蛋白質(zhì)分解代謝強度常以BUN濃度以及汗液、尿液中排出的尿素氮量來加以估計。生理條件下BUN維持穩(wěn)定，蛋白質(zhì)的分解代謝沒有顯著增強。進行長時間運動時，體力消耗則導致蛋白質(zhì)分解代謝增強，BUN濃度呈坡型升高。體內(nèi)缺乏糖原時，就利用蛋白質(zhì)的分解來彌補糖的不足。故BUN也作為評價運動性疲勞強度的重要指標[12]。由此可見，大豆低聚肽能夠減少能源物質(zhì)的消耗，具有抗疲勞效果。

2.3.3 大豆低聚肽對小鼠肝糖原含量的結(jié)果分析及評價 由圖7可知，在小鼠力竭游泳之后，肝糖原含量最高的為高劑量組（17.45±0.36）mg/g，含量最低的為陰性對照組（11.51±0.55）mg/g；灌喂大豆低聚肽的劑量組和陽性對照組的肝糖原含量均明顯高于陰性對照組；并且劑量組的肝糖原含量有比較明顯的升高趨勢。研究證明，在力竭運動之后，需要通過分解肝糖原為機體提供能量。肝臟不斷輸出葡萄糖，是血液中葡萄糖最重要的調(diào)節(jié)器官，內(nèi)源性的葡萄糖有75%左右來自肝糖原分解，其余5%來自糖異生作用[7]。因此肝糖原存儲量可視為體內(nèi)能源物質(zhì)的評價指標[13]。由此可見，大豆低聚肽可增加體內(nèi)肝糖原的含量，為機體供能，具有抗疲勞效果。

圖7 大豆低聚肽對各組小鼠肝糖原含量的影響Fig.7 The effectof soybean oligopeptides on liver glycogen levels for each group ofmice

圖8 大豆低聚肽對各組小鼠肌糖原含量的影響Fig.8 The effectof soybean oligopeptides onmuscle glycogen levels for each group ofmice

2.3.4 大豆低聚肽對小鼠肌糖原含量的結(jié)果分析及評價 由圖8可知，在小鼠力竭游泳之后，肌糖原含量最高的為中劑量（1.53±0.09）mg/g，含量最低的為陰性對照組（0.93±0.07）mg/g；灌喂大豆低聚肽的劑量組和陽性對照組的肌糖原含量均明顯高于陰性對照組；中、高劑量組的肌糖原含量相當，且均高于低劑量組。肌糖原是肌肉中糖的儲存形式，在劇烈運動消耗大量血糖時，肌糖原分解供能，肌糖元不能直接分解成葡萄糖，必須先分解產(chǎn)生乳酸，經(jīng)血液循環(huán)到肝臟，再在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)楦翁窃蚍纸獬善咸烟?。因此肌糖原存儲量也可視為體內(nèi)能源物質(zhì)的評價指標。由此可見，大豆低聚肽可增加體內(nèi)肌糖原的含量，為機體提供儲備能量，具有抗疲勞效果。

3 結(jié)論

以大豆低聚肽為原料，對其抗氧化活性及抗疲勞作用進行了研究。通過與VC對比，對大豆低聚肽清除自由基的能力進行測定并通過動物實驗研究其抗疲勞作用。得出以下結(jié)論：

3.1 大豆低聚肽具有一定的抗氧化活性，總抗氧化能力最大為13.86U/m L，抗超氧陰離子自由基能力最大為158.67U/L，對羥自由基的最大抑制率為17.11%，對烷基自由基的最大抑制率為31.97%。

3.2 大豆低聚肽具有較好的抗疲勞效果，其中力竭游泳時間最長為高劑量組45.51m in，BUN含量最低為高劑量組17.05mmol/L，肝糖原含量最高為高劑量組17.45mg/g，肌糖原最高含量為中劑量組1.53mg/g。

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