魏永義 邵成雷 馬宏偉

山東阿如拉藥物研究開發(fā)有限公司，山東 濟(jì)南 250101

二十九味能消散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

魏永義 邵成雷 馬宏偉

山東阿如拉藥物研究開發(fā)有限公司，山東 濟(jì)南 250101

目的：建立二十九味能消散的質(zhì)量控制方法。方法：采用TLC對(duì)二十九味能消散中肉豆蔻、乳香、大黃、胡椒堿進(jìn)行了定性鑒別；采用高效液相色譜法測(cè)定羥基紅花黃色素A的含量。結(jié)果：薄層色譜斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無(wú)干擾，專屬性強(qiáng)；紅花中羥基紅花黃色素A的線性范圍為10.78～107.8 g，r＝0.9998，平均加樣回收率為98.37%，RSD為1.17%（n＝6）。結(jié)論：本研究建立的薄層色譜方法及高效液相色譜法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，可用于二十九味能消散的質(zhì)量控制。

二十九味能消散；羥基紅花黃色素A；HTC；HPLC；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

二十九味能消散記載于 《藏醫(yī)臨床札記》中，作者云丹嘉措是十三世紀(jì)的著名藏醫(yī)，他經(jīng)多年臨床實(shí)踐總結(jié)，在前人方劑的基礎(chǔ)上炮制出二十九味能消散。因其對(duì)婦女子宮肌瘤和卵巢囊腫的良好療效，被歷代藏醫(yī)學(xué)家所推崇。二十九味能消散由藏木香、寒水石 （煅）、訶子、小米辣、堿花、肉豆蔻、蓽茇、大黃、鐵棒錘、紅花、木香馬兜鈴、黃葵子等29味藥組成的，具有祛寒化痞、消食、調(diào)肝益腎的作用。主要用于食積不化，胃腸肝區(qū)疼痛，腎病，腸病，中毒，肝病，子宮病，黃水散入脈道，胃腸痞病，膽痞病，風(fēng)寒引起的痞瘤等［1］。

二十九味能消散收載于國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：WS3－BC－0140－95。原標(biāo)準(zhǔn)無(wú)定性鑒別和定量檢測(cè)項(xiàng)，為了更好的控制其質(zhì)量，本文建立了肉豆蔻、乳香、大黃、胡椒堿的薄層色譜鑒別方法，并用高效液相色譜法對(duì)紅花中的羥基紅花黃色素A進(jìn)行了含量測(cè)定。經(jīng)試驗(yàn)證明，該方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，可用于二十九味能消散的質(zhì)量控制。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 L－2100型日立高效液相色譜儀（日立公司）；AUW220D電子天平（島津公司）；HH－4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州榮冠試驗(yàn)分析儀器廠）；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱 （北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；ZF－2型三用紫外儀 （上海安亭電子儀器廠）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）

1.2 試藥 乳香對(duì)照藥材（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：120970－200904）；大黃對(duì)照藥材（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：120902－200408）；胡椒堿（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：0775－200203）；肉豆蔻對(duì)照藥材（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：120926－200903）；羥基紅花黃色素A（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111637－200905）；二十九味能消散（青海金訶藏藥藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20110815、20110816、20110817）；陰性對(duì)照樣品自制，所用藥材均符合 《中華人民共和國(guó)藥典》 （2010年版·一部）有關(guān)要求；硅膠G薄層板 （青島海洋化工廠分廠）；高效液相色譜法所用甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 乳香的鑒別［2］取本品粉末3g，加乙醚30m l，超聲處理15min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液；另取乳香對(duì)照藥材0.5g，加乙醚30ml，超聲處理15min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)蛹状?m l使溶解，作為對(duì)照藥材溶液；另取按處方比例配制缺乳香的陰性樣品3g，加乙醚30m l，超聲處理15min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為陰性對(duì)照溶液；照薄層色譜法（《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部附錄VIB）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二甲苯－醋酸乙酯 （8∶2）為展開劑，展開，取出，晾干。噴以1%香草醛硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾，見圖1。

2.1.2 大黃的鑒別［3］取本品粉末3g，加甲醇30m l，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0ml使溶解，加入鹽酸1ml，水浴回流30min，冷卻，用乙醚提取2次，每次10ml，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)尤燃淄?ml使溶解，作為供試品溶液；另取大黃對(duì)照藥材0.5g，加甲醇30ml，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0m l使溶解，加入鹽酸1ml，水浴回流30min，冷卻，用乙醚提取2次，每次10m l，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)尤燃淄?m l使溶解，作為對(duì)照藥材溶液；另取按處方比例配制缺大黃的陰性樣品3g，加甲醇30ml，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0ml使溶解，加入鹽酸1ml，水浴回流30min，冷卻，用乙醚提取2次，每次10ml，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)尤燃淄?ml使溶解，作為陰性對(duì)照溶液；照薄層色譜法 （《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部附錄VIB）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以正己烷 －醋酸乙酯 －甲酸（6∶2∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾，見圖2。

2.1.3 胡椒堿的鑒別［4］取本品粉末3g，加醋酸乙酯30ml，超聲處理30min，濾過，濾液濃縮至2ml，作為供試品溶液；另取胡椒堿適量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的對(duì)照品溶液；另取按處方比例配制缺蓽茇、胡椒的陰性藥材粉末3g，加醋酸乙酯30ml，超聲處理30min，濾過，濾液濃縮至2m l，作為陰性對(duì)照溶液；照薄層色譜法 （《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部附錄VIB）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷－醋酸乙酯 （3∶2）為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外光燈 （365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾，見圖3。

2.1.4 肉豆蔻的鑒別［5］取本品5g，置250ml圓底燒瓶中，加水100ml，煎煮1h，用揮發(fā)油測(cè)定器收集揮發(fā)油（揮發(fā)油測(cè)定器中開始加入少量水及1m l醋酸乙酯），煎煮完成后，收集醋酸乙酯部分，作為供試品溶液；取肉豆蔻對(duì)照藥材1g，置100ml圓底燒瓶中，加水50ml，煎煮1h，用揮發(fā)油測(cè)定器收集揮發(fā)油 （揮發(fā)油測(cè)定器中開始加入少量水及1ml醋酸乙酯），煎煮完成后，收集醋酸乙酯部分，作為對(duì)照藥材溶液；另取按處方比例配制缺肉豆蔻的陰性樣品5g，置250ml圓底燒瓶中，加水100ml，煎煮1h，用揮發(fā)油測(cè)定器收集揮發(fā)油 （揮發(fā)油測(cè)定器中開始加入少量水及1m l醋酸乙酯），煎煮完成后，收集醋酸乙酯部分，作為陰性對(duì)照溶液；照薄層色譜法 （《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部附錄VIB）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二甲苯－醋酸乙酯 （20∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾，見圖4。

2.2 羥基紅花黃色素A含量測(cè)定［6－7］

2.2.1 色譜條件 色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Waters C18色譜柱（250mm×4.6mm，5 m）；流動(dòng)相：甲醇－1%冰醋酸溶液（24∶76）；流速：1.0 ml/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：403nm；進(jìn)樣量：10 l；理論塔板數(shù)按羥基紅花黃色素A峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取羥基紅花黃色素A對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色瓶中，加25%甲醇溶液制成每1ml含50μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末4g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇溶液25m l，密塞，稱定重量，超聲40分鐘，放冷，用25%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方量以相同制劑工藝制備缺少紅花的陰性對(duì)照樣品，照“2.2.2”項(xiàng)下的供試品溶液的制備方法制得陰性樣品溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適用性考察與陰性干擾試驗(yàn) 照“2.2.1”項(xiàng)所述的液相色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10μl，分別注入高效液相色譜儀。試驗(yàn)結(jié)果：供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上檢出相應(yīng)的色譜峰，且羥基紅花黃色素A與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5；陰性對(duì)照溶液在與對(duì)照品溶液色譜峰相應(yīng)的位置上沒有相應(yīng)的色譜峰，表明陰性樣品對(duì)供試品的測(cè)定沒有干擾。結(jié)果見圖5。

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密量取羥基紅花黃色素A對(duì)照品貯備液溶液（羥基紅花黃色素A含量為107.8μg/ml）1ml、3m l、5m l、8m l、10m l，分別置10ml容量瓶中，加25%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，在上述色譜條件下各精密進(jìn)樣10μl，以峰面積（A）對(duì)對(duì)照品濃度 （C）進(jìn)行線性回歸，得羥基紅花黃色素A回歸方程：A＝6605.5C＋454.39，相關(guān)系數(shù)：R＝0.9998。結(jié)果表明，羥基紅花黃色素A在10.78～107.80μg/ml范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液10μl，注入液相色譜儀，連續(xù)測(cè)定6次，記錄峰面積并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照“2.2.3”項(xiàng)所述方法制備供試品溶液，精密吸取同一供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，照“2.2.1”項(xiàng)所述的色譜條件記錄峰面積，以后每隔2小時(shí)測(cè)定一次，考察8小時(shí)，記錄峰面積并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：供試品溶液中羥基紅花黃色素A色譜峰的峰面積平均值為315447，RSD＝0.73%（n＝5），結(jié)果表明，供試品溶液中羥基紅花黃色素A在8小時(shí)內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性考察 取同一批二十九味能消散樣品（生產(chǎn)批號(hào)：20110815）4g，精密稱定，共6份，按照“2.2.3”項(xiàng)所述方法制備供試品溶液，分別精密吸取10μl，注入液相色譜儀，計(jì)算樣品中羥基紅花黃色素A的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：供試品中羥基紅花黃色素A的含量平均值為0.3016mg/g，RSD為1.02%（n＝6）。結(jié)果表明，該分析方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批二十九味能消散樣品（生產(chǎn)批號(hào)：20110815）6份，各精密加入羥基紅花黃色素A對(duì)照品，測(cè)定其含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1，結(jié)果表明，該測(cè)定方法重復(fù)性較好。

表1 羥基紅花黃色素A回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.11 樣品含量測(cè)定 按照“2.2.3”項(xiàng)所述的方法制備供試品，對(duì)三批供試品進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 供試品中羥基紅花黃色素A含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液，于190～500nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，羥基紅花黃色素A在403nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故根據(jù)紫外吸收?qǐng)D譜選定403nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇 研究發(fā)現(xiàn)，以甲醇－1%冰醋酸溶液（20～30：70～80，V/V）為流動(dòng)相時(shí)，羥基紅花黃色素A均能達(dá)到很好的色譜分離效果。其中以甲醇－1%冰醋酸溶液（24：76，V/V）為流動(dòng)相時(shí)效果最好，因此選用甲醇－1%冰醋酸溶液（24：76，V/V）為本試驗(yàn)的流動(dòng)相。

3.3 供試品溶液處理方法的考察 考察了超聲提取、回流提取、振揺提取3種提取方法對(duì)羥基紅花黃色素A提取效果的影響，結(jié)果顯示超聲提取所得供試品溶液中羥基紅花黃色素A含量明顯高于回流提取和振揺提取，故選用提取方法為超聲提?。豢疾炝顺晻r(shí)間分別為30、40、50 min對(duì)羥基紅花黃色素A的提取效果影響，結(jié)果顯示30 min提取不完全，40min、50 min提取所得供試品溶液中羥基紅花黃色素A含量無(wú)明顯差異，故選擇超聲時(shí)間為40min。選擇提取溶劑時(shí)分別考察了水、25%甲醇、甲醇三種溶劑，結(jié)果表明，水、25%甲醇與甲醇所測(cè)的羥基紅花黃色素A含量基本一致，由于用水作提取溶劑過濾困難，純甲醇毒性大，故選用25%甲醇溶液作為提取溶劑。

3.4 該研究結(jié)果表明，肉豆蔻、乳香、大黃、胡椒堿薄層色譜鑒別，分離度好，專屬性強(qiáng)；羥基紅花黃色素A的含量測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可有效控制本品質(zhì)量。

［1］國(guó)家藥品監(jiān)督管理局.二十九味能消散，標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：WS3－BC－0140－95［S］.

［2］張健萍，劉培.活血止疼散的制備與質(zhì)量控制［J］.中國(guó)藥房，2005，16：13）：992－993.

［3］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：22.

［4］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：227.

［5］劉衛(wèi)東，王蘭英，吳維智等.扎沖十三味片的質(zhì)量控制研究 ［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（7）：1647－1648.

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［7］唐穎，朱玉曉，王淑云等.HPLC法測(cè)定樂脈顆粒中丹參素、羥基紅花黃色素A和芍藥苷［J］.中草藥，2008，39（4）：539－541.

Studies on quality standard for Ershijiuwei Nengxiao San

WEIYong－yi，SHAO Cheng－lei，MA Hong－wei
（Shandong Arura Pharmceutical Research＆Development Limited Co.，Ltd.，Jinan 250101，China）

OBJECTIVE：To establish the quality standard of Ershijiuwei Nengxiao San.METHODS：Myristicae Semen，Olibanum，Rhei radix et rhizome，Piperine were identified by TLC.The contents of Hydroxysafflor yellow A was determined by HPLC. RESULTS：The TLC spotswere clear，and the blanktest showed no interference.The linear rangeswere in the range of10.78－107.8 g（r＝0.9998）for Hydroxysafflor yellow A.Themean sample recovery rate of bergenin was98.37%，and the RSD was1.17%（n＝6）.CONCLUSION：This quality standard is accurate and reproducibly，which can be used for quality control of Ershijiuwei Nengxiao San.

Ershijiuwei Nengxiao San；Hydroxysafflor yellow A；HTC；HPLC；Quality standard

R284.1

A

1007－8517（2013）08－0012－03

2013.03.17）

魏永義 （1982年－），男，漢族，山東濟(jì)南人，山東阿如拉藥物研究開發(fā)有限公司，技術(shù)員，助理工程師，主要從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定、新藥研究開發(fā)工作。E－mail：wyy200502＠163.com。