毛彩艷 申元英袁芝瓊 陳紅云 季守蓮 林麗佳

大理學(xué)院，云南 大理 671003

采收于春、秋季云南雞屎藤根體外抗菌對(duì)比研究

毛彩艷 申元英*袁芝瓊 陳紅云 季守蓮 林麗佳

大理學(xué)院，云南 大理 671003

目的：了解采收于春、秋季云南雞屎藤根對(duì)四種實(shí)驗(yàn)菌的體外抗菌作用。方法：采集于春、秋季的云南雞屎藤根的水提取液，用試管稀釋法、平板計(jì)數(shù)法對(duì)金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌進(jìn)行體外抑菌、殺菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：春季采云南雞屎藤根對(duì)金黃色葡萄球菌（25922）的抑菌作用最強(qiáng)，對(duì)綠膿桿菌（ATCC27853）的殺菌作用最強(qiáng)，其對(duì)金黃色葡萄球菌（25922）的抑菌作用、大腸桿菌 （25923）的抑菌、殺菌作用優(yōu)于秋季采云南雞屎藤根。秋季采云南雞屎藤根對(duì)痢疾桿菌 （2a24577）的抑菌作用最強(qiáng)，對(duì)綠膿桿菌的殺菌作用最強(qiáng)，其對(duì)痢疾桿菌（2a24577）、綠膿桿菌（ATCC27853）的抑菌、殺菌作用，對(duì)金黃色葡萄球菌（25922）的抑菌作用均優(yōu)于春季采云南雞屎藤根。結(jié)論：采集于春、秋兩季的云南雞屎藤根的水提取液對(duì)四種實(shí)驗(yàn)菌均具有抑菌、殺菌作用。針對(duì)不同的致病菌感染導(dǎo)致的疾病，應(yīng)選擇不同季節(jié)采收的云南雞屎藤根治療。

春、秋季采收；云南雞屎藤根；體外抗菌；對(duì)比研究

中草藥的來源、產(chǎn)地、采收季節(jié)、炮制加工、煎煮方法的不同，會(huì)影響藥物有效成分及有效成分的含量，最終都會(huì)影響其臨床療效［1］。雞屎藤［Paederia scandens（Lour.）Merr］，又名斑鳩飯、女青、牛皮凍、臭藤、雞矢藤等，主要分布在南亞、東北亞、東南亞各國。藥材用雞屎藤主產(chǎn)云南、貴州、四川、廣西、廣東、福建、安徽、江蘇等省［2］。雞屎藤根在中醫(yī)臨床中常用于治療消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及皮膚感染性疾?。?－7］。雞屎藤根是雞屎藤的主要用藥部位，其采收季節(jié)的不同，將直接影響其有效成份的含量及對(duì)疾病的治療效果［8］。為了解采收于春、秋季節(jié)云南雞屎藤根對(duì)消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及皮膚感染性疾病常見致病菌痢疾桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的體外抗菌作用，作者對(duì)分別于春、秋兩季采收于云南滇中的雞屎藤根的水提取液對(duì)以上四種實(shí)驗(yàn)菌的體外抗菌作用進(jìn)行了對(duì)比研究。

1 材料

1.1 藥材 雞屎藤根：采集于云南滇中地區(qū)大姚縣城西郊坡地，由大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院馬曉匡教授鑒定為云南雞屎藤根。把所采集到的雞屎藤根泥土洗凈，切片曬干后用中藥粉碎機(jī)粉碎過40目篩，把粉碎后的雞屎藤根置于40℃恒溫干燥箱內(nèi)干燥到恒重，收集于密閉保鮮袋常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株 實(shí)驗(yàn)所用菌株金黃色葡萄球菌（25922）、痢疾桿菌（2a24577）、大腸桿菌（25923）、綠膿桿菌（ATCC27853），以上菌種均為標(biāo)準(zhǔn)菌，取自大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE－52A，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)）；SHZ－D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 （鞏義市子華儀器有限責(zé)任公司）；高速中藥粉碎機(jī)（DFY－600）；干燥箱、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、定量濾紙 （快速201，灰分：0.01）、酶標(biāo)儀、96孔板、高壓滅菌鍋等。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)藥液的制備 稱取雞屎藤根各100g，分別加入500m l超純水浸泡30min，煮沸后文火煎20min，各煎煮3次，把3次水煎液濾出混合后用定量濾紙過濾，將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得浸膏春季采收雞屎藤根13g，秋季采收雞屎藤根14g。把所得浸膏120℃高壓滅菌20min后用無菌水稀釋到1g/ml置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 實(shí)驗(yàn)菌液的制備 從保種斜面上挑取菌苔劃線接種到營養(yǎng)瓊脂平板，置于恒溫培養(yǎng)箱37℃下培養(yǎng)18h，挑取單個(gè)菌落接種到5ml肉湯中，在恒溫培養(yǎng)箱37℃下培養(yǎng)18h，取出置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 實(shí)驗(yàn)菌的濃度計(jì)算 用麥?zhǔn)媳葷岱ǖ贸鰧?shí)驗(yàn)菌細(xì)菌濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為：y＝41.658x＋0.5502，R2＝0.9985。把制備好的菌液搖勻后，吸取1ml，用生理鹽水作10倍順序稀釋為10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6搖勻，用移液槍吸取300μl順序放入已讀取過空白板吸光度值的96孔板的微孔里，另吸取300μl生理鹽水作為對(duì)照，作好標(biāo)記［9－10］。用酶標(biāo)儀讀出不同濃度菌液的吸光度，把吸光度數(shù)值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式算出細(xì)菌濃度，取濃度為105cfu/ml的菌液為實(shí)驗(yàn)菌。

2.4 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定 用試管稀釋法測(cè)定分別采集于春、秋兩季的云南雞屎藤根對(duì)四個(gè)實(shí)驗(yàn)菌的最低抑菌濃度 （MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。取10支滅菌有塞試管，分別加入營養(yǎng)肉湯1ml，在第1管中加入實(shí)驗(yàn)藥液1ml，混勻后吸取1ml加入到第2管中，第二管按同樣方法混勻后吸取1ml加入到第3管，依次稀釋到第9管，第9管混勻后棄去1ml，第10管不加藥液作對(duì)照［11］。各管分別加入試驗(yàn)菌液0.1m l，混勻置于恒溫培養(yǎng)箱37℃下培養(yǎng)18h，肉眼觀察無細(xì)菌生長的藥液最低濃度為最低抑菌濃度 （MIC）。測(cè)出最低抑菌濃度（MIC）后，再依次從無細(xì)菌生長的各管中吸取0.1m l培養(yǎng)物分別接種于營養(yǎng)瓊脂平板，置于恒溫培養(yǎng)箱37℃下培養(yǎng)18－24h，數(shù)平板上生長的菌落數(shù)小于5個(gè)的藥液最低濃度為最低殺菌濃度 （MBC）［12］。

3 結(jié)果與分析

3.1 兩個(gè)實(shí)驗(yàn)藥對(duì)四種實(shí)驗(yàn)菌的最低抑菌濃度（MIC）采集于春、秋季云南雞屎藤根的水提取液抗四種試驗(yàn)菌的抑菌作用及最低抑菌濃度（MIC）見附表1。對(duì)表1中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可發(fā)現(xiàn)，兩種實(shí)驗(yàn)藥對(duì)四種實(shí)驗(yàn)菌均有抑菌作用，春季采云南雞屎藤根水提取液對(duì)金黃色葡萄球菌 （25922）的抑菌作用最強(qiáng)，其MIC為0.0000769mg/ml，對(duì)痢疾桿菌（2a24577）、大腸桿菌（25923）、綠膿桿菌（ATCC27853）的抑菌作用相當(dāng)，其MIC均為0.769mg/ml。秋季采云南雞屎藤根對(duì)痢疾桿菌（2a24577）的抑菌作用最強(qiáng)，其MIC為0.0714mg/ml，對(duì)金黃色葡萄球菌（25922）和綠膿桿菌（ATCC27853）的抑菌作用次之，其MIC為0.714mg/ml，對(duì)大腸桿菌（25923）的抑菌作用最差，其MIC為7.14mg/ml。對(duì)比發(fā)現(xiàn)春季采云南雞屎藤根水提取液對(duì)金黃色葡萄球菌（25922）、大腸桿菌（25923）的抑菌作用有突出優(yōu)勢(shì)。秋季采云南雞屎藤根水提取液對(duì)痢疾桿菌（2a24577）、綠膿桿菌（ATCC27853）的抑菌作用有突出優(yōu)勢(shì)。

表1 采收于春、秋季云南雞屎藤根水提取液對(duì)4種實(shí)驗(yàn)菌的最低抑菌濃度 （MIC）

3.2 兩個(gè)實(shí)驗(yàn)藥對(duì)四種實(shí)驗(yàn)菌的最低殺菌濃度（MBC）采集于春、秋兩季云南雞屎藤根的水提取液對(duì)四種試驗(yàn)菌的殺菌作用及最低殺菌濃度（MBC）見附表2。對(duì)表2中數(shù)據(jù)分析可發(fā)現(xiàn)，春、秋季采云南雞屎藤根水提取液對(duì)四種實(shí)驗(yàn)菌均有殺菌作用，并且它們對(duì)綠膿桿菌（ATCC27853）的殺菌作用相比其它實(shí)驗(yàn)菌均較強(qiáng)，其MBC分別為7.69mg/m l、7.14mg/m l，春季采云南雞屎藤根水提取液對(duì)大腸桿菌 （25923）的殺菌作用有突出優(yōu)勢(shì)，其MBC為76.9mg/m l。秋季采云南雞屎藤根水提取液對(duì)痢疾桿菌（2a24577）的殺菌作用有突出優(yōu)勢(shì)，其MBC為71.4mg/ml。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)藥對(duì)金黃色葡萄球菌（25922）的殺菌作用相比其它實(shí)驗(yàn)菌均較弱。

表2 采收于春、秋季云南雞屎藤根水提取液對(duì)4種實(shí)驗(yàn)菌的最低殺菌濃度 （MBC）

4 討論

通過對(duì)采集于春、秋季云南雞屎藤根的水提取液對(duì)四種實(shí)驗(yàn)菌的體外抑菌、殺菌作用的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得出，采集于春、秋兩季的云南雞屎藤根的水提取液對(duì)四種實(shí)驗(yàn)菌均具有抑菌、殺菌作用。對(duì)四種實(shí)驗(yàn)菌的抑菌、殺菌作用相比較，春季采云南雞屎藤根對(duì)金黃色葡萄球菌 （25922）的抑菌作用最強(qiáng)，對(duì)綠膿桿菌（ATCC27853）的殺菌作用最強(qiáng)，其對(duì)金黃色葡萄球菌 （25922）的抑菌作用、大腸桿菌 （25923）的抑菌、殺菌作用優(yōu)于秋季采云南雞屎藤根。秋季采云南雞屎藤根對(duì)痢疾桿菌（2a24577）的抑菌作用最強(qiáng)，對(duì)綠膿桿菌的殺菌作用最強(qiáng)，其對(duì)痢疾桿菌（2a24577）、綠膿桿菌（ATCC27853）的抑菌、殺菌作用、對(duì)金黃色葡萄球菌 （25922）的抑菌作用均優(yōu)于春季采云南雞屎藤根。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，在用云南雞屎藤根治療由痢疾桿菌感染引起的疾病時(shí)，宜首選秋季采挖的雞屎藤根，治療由大腸桿菌感染引起的疾病時(shí)，宜首選春季采挖的雞屎藤根。兩個(gè)季節(jié)采挖的雞屎藤根均適宜用于治療由金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌感染引起的疾病，并且對(duì)綠膿桿菌感染引起的疾病的治療效果更優(yōu)。所以，為了提高藥物的臨床療效，在用云南雞屎藤水煎液治療以上四種實(shí)驗(yàn)菌感染而引起的感染性疾病時(shí)，我們應(yīng)根據(jù)不同的致病菌，選擇不同季節(jié)采收的云南雞屎藤治療。

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R285.5

A

1007－8517（2013）08－0006－02

2013.03.12）

大理學(xué)院青年教師科研基金資助項(xiàng)目 （編號(hào)：KYQN2010－58）；2、“云南省藥用昆蟲及蛛形類資源開發(fā)利用工程實(shí)驗(yàn)室”建設(shè)項(xiàng)目。

毛彩艷，女，（1981－），研究實(shí)習(xí)員，研究領(lǐng)域：中西醫(yī)結(jié)合臨床、流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)、管理學(xué)；研究方向：分子流行病學(xué)、藥物流行病學(xué)、高校管理。

*通訊作者：申元英，女，（1963－），職稱：教授研究領(lǐng)域：感染性疾病及傳染??；臨床醫(yī)學(xué)；基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)；研究方向：醫(yī)學(xué)微生物與免疫學(xué)研究。