郝英杰，羨 鮮，李 勇*，范立僑，焦志凱，張志棟

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科，河北石家莊050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，河北石家莊050017）

·論 著·

基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達(dá)及其與胃癌臨床生物學(xué)行為和預(yù)后的關(guān)系

郝英杰1，羨 鮮2，李 勇1*，范立僑1，焦志凱1，張志棟1

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科，河北石家莊050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，河北石家莊050017）

目的探討在胃癌組織、胃癌區(qū)域淋巴結(jié)及正常胃黏膜中基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrixmetalloproteinases-2，MMP-2）的表達(dá)情況，分析其與胃癌臨床生物學(xué)行為、侵襲轉(zhuǎn)移能力及預(yù)后的關(guān)系。方法選取行胃癌根治術(shù)并經(jīng)病理證實(shí)的胃癌標(biāo)本96例，胃癌區(qū)域淋巴結(jié)96例，正常胃黏膜60例，全部病例均隨訪5年以上。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測上述標(biāo)本中MMP-2的表達(dá)情況。結(jié)果胃癌組織中MMP-2的陽性表達(dá)率明顯高于正常胃黏膜，并隨分化程度的降低、浸潤深度的加深表達(dá)增加，隨臨床分期的增加、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移而明顯增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01）。胃癌區(qū)域淋巴結(jié)組織中，有轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組MMP-2的陽性表達(dá)率明顯高于無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組（P＜0.01）。胃癌患者生存期≥5年組MMP-2表達(dá)陽性率明顯低于生存期＜5年組（P＜0.01）。結(jié)論MMP-2的表達(dá)差異與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切。檢測MMP-2對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的預(yù)測、預(yù)后評估及指導(dǎo)合理的綜合治療等具有重要的臨床意義。

胃腫瘤；基質(zhì)金屬蛋白酶2；免疫組織化學(xué)

胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的主要因素。臨床上有約60％腫瘤患者雖然經(jīng)過有效的治療，但最終還是死于復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是多因素協(xié)調(diào)作用的結(jié)果，其中細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）的降解被認(rèn)為是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的早期信號。作為降解ECM成分最重要的酶——基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs），在這一過程中起著非常重要的作用［1］。其中MMP-2，即Ⅳ型膠原酶，在腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程中起關(guān)鍵作用，其與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系是近年來胃癌研究的熱點(diǎn)，并已成為新的抗腫瘤藥物作用的靶點(diǎn)。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)（SP）法對正常胃黏膜、胃癌組織及區(qū)域淋巴結(jié)組織中MMP-2的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，分析其表達(dá)與胃癌的臨床生物學(xué)行為及預(yù)后的關(guān)系，以探討MMP-2在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用，為預(yù)測胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移、預(yù)后評估及合理的綜合治療等提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2003年9月—2005年5月于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科行胃癌根治術(shù)并經(jīng)病理證實(shí)的患者，男性70例，女性26例，年齡28～75歲，平均（56.0±10.6）歲，取胃癌組織96例，胃癌區(qū)域淋巴結(jié)96例，正常胃黏膜60例，所有胃癌臨床記錄均按“全國胃癌診治規(guī)范”進(jìn)行登記。病理診斷結(jié)果均經(jīng)2名以上病理主治醫(yī)師確認(rèn)，術(shù)前均未接受放療和化療，臨床病歷資料完整。全部病例均隨訪5年以上。

1.2 方法

1.2.1 臨床及病理資料分組：按“全國胃癌診治規(guī)范”進(jìn)行分組，分析不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、Borrmann分型、分化程度、浸潤深度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生存期的MMP-2表達(dá)情況。

1.2.2 主要試劑：一抗，鼠抗人MMP-2單克隆抗體，均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。免疫組織化學(xué)染色試劑盒，封閉用正常山羊血清，生物素標(biāo)記二抗IgG，辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，均為美國Zymed公司產(chǎn)品，購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色方法：取手術(shù)切除的胃癌組織、區(qū)域淋巴結(jié)組織及正常胃黏膜組織標(biāo)本放入10％中性緩沖福爾馬林液中固定24h，常規(guī)石蠟包埋，行4μm連續(xù)切片，一式3份，每例取一張作常規(guī)病理組織檢查（HE染色），進(jìn)行病理學(xué)分析，其余2張進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。應(yīng)用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素染色進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。石蠟切片脫蠟，3％H2O2去離子水封閉內(nèi)源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗、浸泡后置于枸櫞酸鹽緩沖液內(nèi)加熱至98℃20min進(jìn)行抗原修復(fù)。羊血清封閉10min，切片滴加一抗后37℃孵育60min，PBS沖洗后滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育20min。PBS沖洗后滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，37℃孵育20min。PBS沖洗后，蘇木素復(fù)染、脫水、中性樹脂封片，鏡下觀察結(jié)果。

1.2.4 檢查結(jié)果判斷：用PBS代替一抗作陰性對照，用已知的陽性切片作陽性對照。染色結(jié)果判定以腫瘤細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，高倍鏡下取4個(gè)視野各計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，按陽性細(xì)胞所占百分比將染色結(jié)果分為陽性細(xì)胞＜5％為（-），陽性細(xì)胞5％～25％為（+），陽性細(xì)胞＞25％～50％為（++），陽性細(xì)胞＞50％為（++ +）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 正常胃黏膜、胃癌組織、區(qū)域淋巴結(jié)中MMP-2表達(dá)：正常胃黏膜組織（圖1）60例。胃癌組織（圖2）96例，其中高中分化腺癌58例，可見癌細(xì)胞呈大腺管狀或乳頭狀；低分化腺癌38例，可見癌細(xì)胞

排列無明顯腺管。胃癌區(qū)域淋巴結(jié)96例，其中無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)（圖3）42例，淋巴結(jié)組織內(nèi)未見轉(zhuǎn)移灶；有轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)（圖4）54例，淋巴結(jié)組織內(nèi)可見轉(zhuǎn)移癌灶。MMP-2在正常胃黏膜中的表達(dá)主要表現(xiàn)為陰性或弱陽性（圖5）。在胃癌組織及淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中MMP-2的表達(dá)均位于腫瘤細(xì)胞的胞漿內(nèi)，為胞漿內(nèi)散在或彌漫性分布的粗細(xì)不等的棕黃色顆粒，未見胞核著色（圖6，7）。在無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中MMP-2的表達(dá)主要表現(xiàn)為陰性或弱陽性（圖8）。正常胃黏膜中MMP-2表達(dá)的陽性率為43.3％，胃癌組織中MMP-2的陽性表達(dá)率為66.7％，明顯較正常胃黏膜的表達(dá)增高，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。胃癌區(qū)域淋巴結(jié)組織中，無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組MMP-2的表達(dá)陽性率為2.4％，有胃癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組MMP-2的表達(dá)陽性率為63.0％，明顯高于無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組MMP-2的表達(dá)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

表1 胃癌組織與正常胃黏膜組織中MMP-2的表達(dá)Table 1 Expression of MMP-2 in gastric carcinoma tissues and normalgastric mucosa（n，％）

表2 胃癌區(qū)域淋巴結(jié)組織中MMP-2的表達(dá)Table 2 Expression of MMP-2 in gastric regional lymph node tissues（n，％）

2.2 胃癌組織中MMP-2表達(dá)與其臨床生物學(xué)行為之間的關(guān)系：在不同性別、年齡、腫瘤部位、大小及Borrmann分型胃癌組織中MMP-2陽性表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。低分化組較高中度分化組MMP-2表達(dá)陽性率高、浸潤深度T3+T4組較T1+ T2組MMP-2表達(dá)陽性率高、臨床分期Ⅲ～Ⅳ組較Ⅰ～Ⅱ組MMP-2表達(dá)陽性率高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組MMP-2表達(dá)陽性率高、生存期＜5組較≥5年組MMP-2表達(dá)陽性率高（P＜0.05或P＜0.01）。見表3。

表3 胃癌組織中MMP-2表達(dá)與其臨床生物學(xué)行為之間的關(guān)系Table 3 Expression of MMP-2 in gastric carcinoma tissues and clinicalbiological characteristics in patients w ith gastric carcinoma（n，％）

3 討 論

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征之一，也是引起治療失敗的主要原因。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是經(jīng)多步驟發(fā)生的結(jié)果，基底膜降解、穿透循環(huán)到達(dá)血管外、侵襲靶器官和形成轉(zhuǎn)移的特征，涉及增殖、遷移、蛋白溶解和血管生成等過程［2］。其中，ECM的分解被認(rèn)為是浸潤和轉(zhuǎn)移的早期信號，ECM的降解及基底膜的破壞需要MMPs來完成。MMPs是一組鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，可以降解ECM和基底膜成分以及一些非基質(zhì)成分，從而改變腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。MMPs與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系已成為新的抗腫瘤藥物作用的靶點(diǎn)，也是近年來腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移研究的熱點(diǎn)。MMPs產(chǎn)生于正常組

織細(xì)胞（結(jié)締組織細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、胸腺細(xì)胞等）和腫瘤細(xì)胞中，以酶原形式分泌。其中MMP-2即明膠酶A是MMPs家族中的重要成員，它的主要水解底物是變性膠原、Ⅳ型膠原等，還可以分解糖蛋白成分纖維連接蛋白和層黏連蛋白［3］，且與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。MMP-2與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系已在頭頸部腫瘤、胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌［4-7］等的研究中得到證實(shí)。胃癌作為我國最常見的惡性腫瘤之一，其高侵襲和轉(zhuǎn)移的特性是影響患者預(yù)后的主要因素，及時(shí)診斷并阻止其侵襲轉(zhuǎn)移是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。MMP-2作為ECM的主要降解酶，參與ECM的降解過程，研究MMP-2在胃癌患者組織中的表達(dá)，揭示其生物學(xué)特性，對探究胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移具有非常重要的意義。本研究采用免疫組織化學(xué)方法（SP）檢測MMP-2在胃癌組織、區(qū)域淋巴結(jié)組織及正常胃黏膜中的表達(dá)，分析其與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的能力、胃癌臨床生物學(xué)行為及預(yù)后的關(guān)系。旨在尋找特異性較好的指標(biāo)，為胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的預(yù)測、預(yù)后評估及合理的綜合治療等提供有力的理論依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中MMP-2的陽性表達(dá)率為66.7％，正常胃黏膜中MMP-2的陽性表達(dá)率為43.3％，胃癌組織中的MMP-2的陽性表達(dá)率較正常胃黏膜明顯增高（P＜0.01）。與文獻(xiàn)報(bào)道一致［8］。說明胃癌發(fā)生后，MMP-2表達(dá)增強(qiáng)，具備了侵襲轉(zhuǎn)移的能力。胃癌的臨床生物學(xué)行為與患者的預(yù)后有關(guān)，尤其是腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等。MMP-2的過表達(dá)已被證實(shí)與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［9］。近年來體外實(shí)驗(yàn)［10］也證實(shí)，MMP-2也可以調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的侵襲能力，低分化癌細(xì)胞MMP-2表達(dá)的陽性率顯著高于高中分化者，進(jìn)展期胃癌MMP-2的陽性表達(dá)率高于早期胃癌。

本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中MMP-2表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤部位、大小和Borrmann分型均無關(guān)（P＞0.05）；但在分化程度中，低分化組陽性表達(dá)率較高中分化組明顯增高；浸潤深度中，T3+T4組陽性表達(dá)率較T1+T2組明顯增高；臨床分期中，Ⅲ～Ⅳ組陽性表達(dá)率較Ⅰ～Ⅱ組明顯增高；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯增高（P＜0.05或P＜0.01）。本研究還發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中MMP-2表達(dá)陽性率在生存期≥5年組為45.9％，在生存期＜5組為79.7％，MMP-2表達(dá)陽性率生存期≥5年組較＜5年組明顯降低（P＜0.01）。分析其原因：在腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞突破ECM是非常重要的步驟，而Ⅳ型膠原為ECM的組成成分之一，具有獨(dú)特螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，只有Ⅳ型膠原酶能降解其成分，從而破壞ECM的完整性。Ⅳ型膠原酶有2種分子類型，相對分子質(zhì)量為72 000的MMP-2和92 000的MMP-9。而在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中MMP-2起著較MMP-9更為重要的作用。本研究表明，MMP-2隨著胃癌分化程度的降低、浸潤深度的加深、臨床分期的增加、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，其陽性表達(dá)率顯著增高。說明胃癌侵襲轉(zhuǎn)移能力逐漸增強(qiáng)，表達(dá)陽性者預(yù)后差，5年生存率明顯降低；胃癌組織中MMP-2的表達(dá)與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移程度及預(yù)后關(guān)系密切，是腫瘤惡性進(jìn)展的標(biāo)志。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌轉(zhuǎn)移的重要途徑，亦是影響胃癌患者預(yù)后的重要因素。本研究結(jié)果顯示，胃癌區(qū)域淋巴結(jié)組織中，按淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分組，無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組MMP-2的表達(dá)陽性率為2.4％，有轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組MMP-2的表達(dá)陽性率為63.0％，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。MMP-2表達(dá)陽性有利于甚至加強(qiáng)了胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，使患者預(yù)后較差。

綜上所述，胃癌組織中MMP-2表達(dá)的失調(diào)與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后有著十分密切的關(guān)系，是胃癌侵襲轉(zhuǎn)移重要的分子學(xué)基礎(chǔ)，其表達(dá)的上升意味著胃癌侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，患者預(yù)后較差。區(qū)域淋巴結(jié)組織中MMP-2表達(dá)的異常也與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，其表達(dá)率的上升加強(qiáng)了胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，聯(lián)合檢測胃癌組織及區(qū)域淋巴結(jié)組織中MMP-2的表達(dá)對于預(yù)測胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的情況、患者預(yù)后評估及提出更合理的綜合治療方案具有十分重要的臨床意義。（本文圖見封二）

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（本文編輯：劉斯靜）

EXPRESSION OF MATRIX METALLOPRTEINASE-2 AND ITSRELATIONSHIP W ITH BIOLOGICAL BEHAVIOR AND PROGNOSIS OF HUMAN GASTRIC CACNER

HAO YingJie1，XIAN Xian2，LIYong1*，F(xiàn)AN Liqiao1，JIAO Zhikai1，ZHANG Zhidong1
（1.Third Department of General Surgery，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang
050011，China；2.Department of Pathogen Biology，the School of Basic Medical Sciences，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

Objective To evaluate the expression ofmatrix metalloproteinase-2（MMP-2）in human gastric cancer tissues，gastric regional lymph nodes and normal gastric mucosa tissues，analyze the relationship between its expression level and biological behavior，invasion and metastasis of human gastric cancer.MethodsSixty cases of normal gastric mucosa tissues，96 cases of pathologically confirmed gastric cancer specimens and 96 cases of gastric regional lymph nodeswere selected，and all patientswere followed up formore than five years.The immunohistochemicalmethod was used to detect the expression level of MMP-2 in different tissues.ResultsThe positive expression rate of MMP-2 in gastric cancer tissueswas significantly higher than that in normal gastric mucosa，and the expression was increased with the declined degree of differentiation and depth of invasion of tumors.The expression of MMP-2 was significantly enhanced with lymph node metastasis and clinical stage（P＜0.05 or P＜0.01）.MMP-2 expression of regional lymph nodes of gastric cancer was significantly higher in metastatic lymph node

stomach neoplasms；matrixmetalloproteinase 2；immunohistochemistry

R735.2

A

1007-3205（2013）06-0621-05

2012-09-04；

2013-01-28

郝英杰（1979-），男，河北深縣人，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士研究生，從事普通外科疾病診治研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.06.001

group than that of non-metastatic lymph node group（P＜0.01）.The MMP-2 expression in gastric carcinoma tissue of patients with survival rate more than 5 years was significantly lower than those with survival rate less than 5 years（P＜0.01）.ConclusionMMP-2 expression was closely related to the invasion，metastasis and prognosis of gastric cancer.Detection of MMP-2 has important clinical significance in the invasion and metastasis prediction，prognosis evaluation and guiding rational treatment of gastric cancer.