王亦菁 張曉東 于 華 金 巖

大鼠牙髓干細(xì)胞、外胚間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞表型的實(shí)驗(yàn)研究

王亦菁 張曉東 于 華 金 巖

目的檢測(cè)組織特異性分化標(biāo)記在大鼠牙髓干細(xì)胞（DPSC）、外胚間充質(zhì)干細(xì)胞（EMSC）及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）中的表達(dá)，探討三者細(xì)胞表型的異同。方法通過(guò)免疫組化檢測(cè)大鼠DPSC、EMSC、BMSC三種細(xì)胞的表型；RT-PCR檢測(cè)DPSC、EMSC、BMSC的DSPP mRNA表達(dá)。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，三種細(xì)胞對(duì)于不同細(xì)胞的表面標(biāo)志有不同程度的表達(dá)；RT-PCR顯示，DSPP的mRNA在大鼠DPSC、EMSC中不表達(dá)，在BMSC中弱表達(dá)。結(jié)論DPSC與EMSC的細(xì)胞表型具有一定的相關(guān)性和延續(xù)性。

牙髓干細(xì)胞外胚間充質(zhì)干細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞表型

外胚間充質(zhì)干細(xì)胞（Ecto-mesenchymal stem cells，EMSC）來(lái)源于神經(jīng)嵴干細(xì)胞（Cranial neural crest stem cells，CNCSC），周澤淵等[1]的研究表明，二者的基因表達(dá)譜具有延續(xù)演變性。來(lái)源于外胚間充質(zhì)的牙髓組織中包含的牙髓干細(xì)胞（Dental pulp stem cells，DPSC）與EMSC之間的基因和蛋白表達(dá)模式的異同，是理解牙齒發(fā)生過(guò)程的中樞環(huán)節(jié)，對(duì)于揭示干細(xì)胞的遷移，闡明干細(xì)胞的來(lái)源具有重要意義。目前由于缺乏對(duì)前成牙本質(zhì)細(xì)胞群特異性標(biāo)志的認(rèn)識(shí)，無(wú)法對(duì)DPSC進(jìn)行準(zhǔn)確定位。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化和RT-PCR檢測(cè)一些組織特異性分化標(biāo)記（HNK-1是EMSC特異的標(biāo)記分子之一）在大鼠DPSC、EMSC、BMSC中的表達(dá)，分析三種細(xì)胞表型的異同，為研究DPSC、EMSC的關(guān)系，揭示DPSC的來(lái)源，尋找DPSC的特異性標(biāo)記提供線索。

目前，普遍通過(guò)干細(xì)胞的表面標(biāo)志來(lái)區(qū)分和鑒定各種干細(xì)胞，主要是利用熒光素或酶的化學(xué)特性與細(xì)胞表面受體獨(dú)特的結(jié)構(gòu)相結(jié)合的方法來(lái)鑒別干細(xì)胞群。不同組織的干細(xì)胞具有自身的特性及特異的表面標(biāo)志，DPSC、EMSC的表型分析將有助于了解二者在發(fā)育演變過(guò)程中的相關(guān)性，為揭示DPSC的來(lái)源提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

高速低溫離心機(jī)（SIGMA-1K15）、Peltier Thermal Cycler PTC-100 PCR儀（MJ Research），數(shù)碼凝膠成像和分析系統(tǒng)（Biolmaging systems GDS-800），核酸及蛋白定量?jī)x（Biophotometer），ZDY2A電泳儀（南京）。

ExTaq DNA聚合酶、DL2000 DNA marker、10× DNA上樣緩沖液（Takara，日本）；Trizol、superscriptTM II反轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen，美國(guó)）；PolyAT-tractR System（Promega，美國(guó)）；引物合成（上海生工）；LSAB加強(qiáng)型免疫組化試劑盒（DAKO，美國(guó)）；DAB顯色系統(tǒng)（武漢博士德公司）。

抗基質(zhì)蛋白-1單克隆抗體（STRO-1，R&D，美國(guó)）、抗波形絲蛋白多克隆抗體（VIM，DAKO，美國(guó)）、抗成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子多克隆抗體（FGF，DAKO，美國(guó)）、抗第Ⅷ因子多克隆抗體（DAKO，美國(guó)）、抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白單抗（α-SMA，Sigma，美國(guó)）、抗S-100多克隆抗體（DAKO，美國(guó)）、抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白多克隆抗體（GFAP，DAKO，美國(guó)）、抗Nestin單抗（DAKO，美國(guó)）、抗LNGFR/P75多抗（Santz Cruz，美國(guó)）、抗EMA單克隆抗體（DAKO，美國(guó)）、抗LA多克隆抗體（DAKO，美國(guó)）、抗CD14單克隆抗體（DAKO，美國(guó)）、抗牙本質(zhì)涎蛋白多克隆抗體（DSP，Santz Cruz，美國(guó)）、抗牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白多克隆抗體（DMP，Santz Cruz，美國(guó)）；抗骨涎蛋白（BSP）、抗骨基質(zhì)蛋白（BMP）、抗骨橋素（OPN）、抗Ⅰ型膠原、抗Ⅲ型膠原、抗Ⅱ型膠原多克隆抗體（L.Fisher饋贈(zèng)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將DPSC、EMSC、BMSC原代培養(yǎng)，細(xì)胞懸液以1×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)，鏡下觀察培養(yǎng)板中細(xì)胞克隆情況，用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 DPSC、EMSC、BMSC細(xì)胞表型免疫組化鑒定

將三種細(xì)胞各取2株克隆，接種于預(yù)先消毒處理過(guò)的小蓋玻片（8 mm×8 mm）上，37℃孵育24 h，0.1 mol/L PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定30 min，經(jīng)梯度乙醇至水。按照LSAB加強(qiáng)型免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞的免疫組化染色。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)DPSC、EMSC、BMSC的DSPP mRNA表達(dá)

提取DPSC、EMSC、BMSC總RNA；

引物合成：按照Genbank登陸的基因DSPPm-RNA序列及引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)如下：片段長(zhǎng)度為464 bp。①5'-AGACACGGGTTCTGGTGATGGT-3'；②5'-CCCTTGCTTTGGGCTATTCCTT-3'。

RT-PCR反應(yīng)體系：10×PCRbuffer5μL，25 pmol/μL引物1μL，cDNA模板2μL，10 mmol/L dNTP 1μL，ExTaq DNA聚合酶0.5μL，加水至50μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性45 sec，56℃退火45 sec，72℃延伸60 sec，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RTPCR產(chǎn)物。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞表型免疫組化鑒定結(jié)果

DAB顯色，陽(yáng)性結(jié)果為程度不等的棕黃色，分別記為++、+、±和-。陰性對(duì)照的胞漿和胞膜均無(wú)特異性染色（表1）。

2.2 RT-PCR結(jié)果

DSPP的mRNA在大鼠DPSC、EMSC中未檢測(cè)到，在BMSC中有弱的表達(dá)（圖1）。

圖1 RT-PCR檢測(cè)DSPP mRNA在DPSC、EMSC、BMSC中的表達(dá)Fig.1 The mRNA expression of DSPP in rat DPSC,EMSC and BMSC

表1 大鼠DPSC、BMSC、EMSC細(xì)胞表型的免疫組化結(jié)果Table 1 The phenotype of rat DPSC,BMSC and EMSC detected by immunohistochemistry

3 討論

免疫組化結(jié)果顯示，隨機(jī)選取的DPSC克隆株細(xì)胞表型呈現(xiàn)多樣性。干細(xì)胞具有自身的特性，表達(dá)與其來(lái)源相關(guān)的某些特異性標(biāo)志[2]，而成纖維細(xì)胞廣泛存在于各組織中，并有一定的組織特異性。本組免疫組織化學(xué)染色顯示，DPSC強(qiáng)表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志STRO-1，表達(dá)成纖維細(xì)胞的標(biāo)志波形絲蛋白，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，還表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志（如第Ⅷ因子），平滑肌的標(biāo)志（如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白），弱表達(dá)骨標(biāo)志（如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、骨橋素等）。DPSC不表達(dá)軟骨標(biāo)志Ⅱ型膠原，上皮細(xì)胞的標(biāo)志EMA，淋巴細(xì)胞的標(biāo)志LA，造血細(xì)胞的標(biāo)志CD14。此結(jié)果提示，大鼠DPSC同BMSC一樣，同表達(dá)間充質(zhì)來(lái)源的組織細(xì)胞的特征標(biāo)志。本組結(jié)果與Gronthos等[3]對(duì)于人來(lái)源的DPSC表型研究的報(bào)道相似。李盛琳等[4]也發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的人DPSC表達(dá)骨鈣素、骨涎蛋白、骨連結(jié)蛋白和Ⅰ型膠原。另組實(shí)驗(yàn)也觀察到大鼠DPSC的表達(dá)譜與人來(lái)源的DPSC表達(dá)譜相似[5]，表達(dá)的強(qiáng)弱有部分差異，可能是種屬間的差異，也可能是操作誤差造成的，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

由于對(duì)DPSC的確切來(lái)源不甚清楚，因而無(wú)法對(duì)其進(jìn)行定位、分離、鑒定。Shi等[6]通過(guò)cDNA微陣列分析，比較了人來(lái)源DPSC和BMSC的表型差異，發(fā)現(xiàn)二者有超過(guò)4 000個(gè)基因的表達(dá)水平是一致的，包括細(xì)胞外基質(zhì)成分、細(xì)胞黏附分子、成骨特異性調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子、骨相關(guān)的標(biāo)志分子、調(diào)節(jié)牙本質(zhì)和骨形成的生長(zhǎng)和分化因子等。對(duì)于表達(dá)不同的基因，通過(guò)RT-PCR、Northern blot等分子生物學(xué)方法得以確認(rèn)，結(jié)果顯示18型α-1膠原、胰島素樣生長(zhǎng)因子2型（IGF-2）、絡(luò)氨酸激酶、NAD(P)-氧化還原酶、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶-6（CDK6）在DPSC中高表達(dá)，而胰島素樣生長(zhǎng)因子連接蛋白-7（IGFBP-7）和Ⅰ型α-2膠原在BMSC中高表達(dá)。因?yàn)槌裳辣举|(zhì)細(xì)胞的分化與成骨細(xì)胞的分化，牙本質(zhì)和骨的成分均有許多相似之處，本組實(shí)驗(yàn)以BMSC為參照，追蹤研究DPSC的來(lái)源，將其與EMSC的特異性細(xì)胞表型進(jìn)行初步分析檢測(cè)，結(jié)果表明二者的細(xì)胞表型具有一定的相關(guān)性。已有研究表明EMSC免疫組化抗NSE(+)、NF(+)、Nestin(+)、S-100(+)、GFAP(-)，說(shuō)明該細(xì)胞表達(dá)Nestin、NSE、NF等神經(jīng)特異標(biāo)志，不表達(dá)GFAP神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志；抗Vimentin(+)說(shuō)明該細(xì)胞也表達(dá)中胚層的特異性標(biāo)志。因此認(rèn)為該細(xì)胞具有兩個(gè)胚層的特點(diǎn)，是一種具有外胚層特征的間充質(zhì)干細(xì)胞[1]。本組結(jié)果顯示，DPSC和EMSC都表達(dá)神經(jīng)譜系的標(biāo)志S-100，而B(niǎo)MSC基本不表達(dá)。S-100是神經(jīng)嵴來(lái)源的間充質(zhì)前體細(xì)胞的標(biāo)志，S-100可以區(qū)分口腔顱面部的外胚間充質(zhì)和來(lái)源于中胚層的間充質(zhì)，其免疫活性的分布可以對(duì)外胚間充質(zhì)的范圍有初步的了解。而神經(jīng)前體細(xì)胞的標(biāo)志抗HNK-1的著色則較為特別，EMSC細(xì)胞均有著色，但著色程度有差別，大部分細(xì)胞著色較深，少部分細(xì)胞著色較淺，其在DPSC中的表達(dá)也較為普遍，但是大部分陽(yáng)性著色較淺，少部分著色深。HNK-1為遷移中神經(jīng)嵴細(xì)胞的特異性抗體，在其他的中胚層細(xì)胞和內(nèi)、外胚層的細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，因而用抗HNK-1單抗可以將來(lái)源于顱神經(jīng)嵴的EMSC和其他細(xì)胞分開(kāi)，是已確認(rèn)的遷移的神經(jīng)嵴細(xì)胞的標(biāo)志[7]。本組結(jié)果表明，牙髓組織中存在的DPSC表達(dá)EMSC相對(duì)特異性的表面標(biāo)志，提示其極有可能是EMSC在機(jī)體發(fā)育成熟后殘留于牙髓組織中的細(xì)胞成分，但在細(xì)胞遷移的過(guò)程中細(xì)胞的表型有部分變化，表達(dá)的量有所差異，可能是部分細(xì)胞發(fā)生分化造成的。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，成牙本質(zhì)細(xì)胞來(lái)源于外胚層間充質(zhì)，成骨細(xì)胞來(lái)源于中胚層間充質(zhì)的中軸和外層骨[8]。本研究中，BMSC也弱表達(dá)許多神經(jīng)譜系的標(biāo)志，與外胚間充質(zhì)細(xì)胞相似，但BMSC還表達(dá)一些成熟的成骨細(xì)胞標(biāo)志，如BMP、BSP等[9]，而EMSC、DPSC卻不表達(dá)，提示它們代表著不同的間充質(zhì)干細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR檢測(cè)了牙本質(zhì)特異性蛋白分子DSPP在三種細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果顯示，大鼠來(lái)源的細(xì)胞中，BMSC中DSPP有弱表達(dá)。已有研究表明，兩種基質(zhì)蛋白DSP、DPP只表達(dá)于牙本質(zhì)中，二者由單獨(dú)的基因DSPP編碼[10-12]。體外實(shí)驗(yàn)表明，DSPP抗體只在成熟的牙本質(zhì)層細(xì)胞中表達(dá)。動(dòng)物模型研究RT-PCR結(jié)果顯示，鼠切牙來(lái)源的牙乳頭細(xì)胞不表達(dá)DSPP的mRNA，相反新鮮分離的成牙本質(zhì)細(xì)胞-牙髓組織中檢測(cè)到DSPP的高表達(dá)[13]。而本組DPSC、EMSC屬于未分化的干細(xì)胞群，因此不表達(dá)成熟的牙本質(zhì)特異性蛋白。免疫組化結(jié)果表明，大鼠來(lái)源的EMSC弱表達(dá)DMP。EMSC對(duì)于DMP的弱表達(dá)可能是由于其中含有一部分已分化的細(xì)胞，但在mRNA水平未檢測(cè)到。對(duì)于大鼠BMSC低表達(dá)DSPP的mRNA，有研究報(bào)道DSPP表達(dá)于骨組織[14]，盡管是低水平表達(dá)，仍提示DSPP有可能是一種骨性標(biāo)志，還需進(jìn)一步的分析鑒定。

不同胚胎干細(xì)胞因來(lái)源（胚泡的內(nèi)細(xì)胞群）而定義，而成體干細(xì)胞（ASC）非常稀少，起源不很清楚，因此沒(méi)有確定的特征含義。目前鑒定ASC是依賴于細(xì)胞表面標(biāo)志，觀察它們?cè)谠嚬芎团囵B(yǎng)皿中的分化模式。因此ASC的來(lái)源是干細(xì)胞研究的主要內(nèi)容之一，明確ASC是否是胚胎干細(xì)胞的“殘余”還是由其他路徑產(chǎn)生、它與周圍環(huán)境的關(guān)系如何等等，將有助于了解人體內(nèi)共有多少種干細(xì)胞，它們分別存在于哪些組織器官，它們的組織學(xué)表型和生物學(xué)功能是如何的。Suzuki等[15]從小鼠胚胎肝臟分離出能夠在體外克隆水平擴(kuò)增，不僅能產(chǎn)生肝臟和膽管上皮，而且形成胰臟和胃腸道上皮的細(xì)胞。表明ASC的前體細(xì)胞可能在胚胎發(fā)育早期就已存在，依賴于周圍環(huán)境而分化為不同于來(lái)源組織的細(xì)胞。在口腔頜面部發(fā)育中，顱神經(jīng)嵴干細(xì)胞（CNCSC）廣泛遷移至胚胎面突外胚間充質(zhì)的過(guò)程中，一部分細(xì)胞可以繼續(xù)保留干細(xì)胞的特性，因此在外胚間充質(zhì)中也有保留下來(lái)的多能干細(xì)胞。DPSC這種來(lái)源于牙髓組織的ASC是否就是牙髓組織存在的殘余EMSC，對(duì)于二者表型的深入分析研究，包括大范圍的基因芯片檢測(cè)、細(xì)胞的標(biāo)記追蹤研究、干細(xì)胞的克隆分析等將對(duì)于揭示DPSC的來(lái)源及其定位鑒定具有重要意義。

[1]周澤淵,金巖,史俊南,等.大鼠外胚間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)研究[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,2004,14(5)：179-181.

[2]Verfaillie CM,Pera MF,Lansdorp PM.Stem cells：hype and reality [J].Hematology Am Soc Hematol Educ Program,2002：369-391.

[3]Gronthos S,Brahim J,Li W,et al.Stem cell properties of human dental pulp stem cells[J].J Dent Res,2002,81(8)：531-532.

[4]李盛琳,王衣祥,施松濤,等.牙髓干細(xì)胞體內(nèi)外礦化能力及生物學(xué)特性的研究[C].第三屆中國(guó)國(guó)際暨第六屆全國(guó)口腔頜面外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編.北京：[出版者不詳],2002：405-406.

[5]王亦菁,金巖,史俊南,等.人牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)及其細(xì)胞表型分析的研究[J].臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志,2005,21(1)：23-25.

[6]Shi S,Robey PG,Gronthos S.Comparison of human pulp and marrow stromal stem cells by cDNA microarray analysis[J].Bone, 2001,29(6)：532-539.

[7]Shimoda Y,Tajima Y,Nagase T,et al.Cloning and expression of a novel galactoside beta1,3-glucuronyltransferase involved in the biosynthesis of HNK-1 epitope[J].J Biol Chem,1999,274(24)：17115-17122.

[8]Brenton S,Nathalie B,Teresa OS,et al.Mesenchymal stem cells [J].Arch Med Res,2003,34(6)：565-571.

[9]Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284 (5411)：143-147

[10]Ritchie H,Hou H,Veis A,etal.Cloning and sequence determination of rat dentin sialoprotein,a novel dentin protein[J].J Biol Chem, 1994,269(5)：3698-3702.

[11]Gorter de Vries I,Quartier E,Van Steirteghem A,et al.Characterization and immunocytochemical localization of dentine phosphoprotein in rat and bovine teeth[J].Arch Oral Biol,1986, 31(1)：57-66.

[12]MacDougall M,Simmons D,Luan X,et al.Dentin phosphoprotein and dentin sialoprotein are cleavage products expressed from a single transcript coded by a gene on human chromosome Dentin phosphoprotein DNA sequence determination[J].J Biol Chem, 1997,272(2)：835-842.

[13]Dey R,Son H,Cho H,et al.Isolation and partial sequencing of potentially odontoblast-specific/enriched rat cDNA clones obtained by suppression subtractive hybridization[J].Arch Oral Biol, 2001,46(3)：249-260.

[14]Qin C,Brunn JC,Cadena E.The expression of dentin sialophosphoprotein gene in bone[J].J Dent Res,2002,81(6)：392-394.

[15]Suzuki A,Nakauchi H,Taniguchi H.Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting[J].Diabetes,2004,53(8)：2143-2152.

Phenotype of Rat Dental Pulp Stem Cell and Ectomesenchymal Stem Cell

WANG Yijing1,ZHANG Xiaodong1,YU Hua1,JIN Yan2.1 Department of Stomatology,The General Hospital of Shenyang Military Region,Shenyang 110840,China;2 School of Stomatology,Fourth Military Medical Hospital,Xi'an 710032,China.Corresponding author:WANG Yijing(E-mail: kpaba@sina.com.cn).

ObjectiveTo investigate the expression of special differentiation marker in dental pulp stem cell(DPSC), ectomesenchymal stem cell(EMSC)and bone mesenchymal stem cell(BMSC),to compare the difference of the phenotype among the three kinds of cell.MethodsThe phenotype of rat DPSC,EMSC and BMSC was described by immunohistochemistry.The mRNA expression of DSPP in rat DPSC,EMSC and BMSC was detected by RT-PCR.ResultsImmunohistochemistry showed different degree of expression of cell surface markers in the three kinds of cells.The DSPP mRNA was not detected in rat DPSC and EMSC,but little detected in BMSC by RT-PCR.ConclusionThe special cell phenotypes of rat DPSCs and EMSC were in possession of certain relevance and continuity.

Dental pulp stem cell;Ectomesenchymal stem cell;Bone mesenchymal stem cell;Cell phenotype

Q813.1+1

A

1673－0364（2013）06－0315－04

2013年9月6日；

2013年10月21日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.06.004

110840遼寧省沈陽(yáng)市沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院口腔內(nèi)科（王亦菁，張曉東，于華）；710032陜西省西安市第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院（金巖）。

王亦菁（E-mail：kpaba@sina.com.cn）。