康寧 劉霞 曹誼林 肖苒

先天性小耳畸形表現(xiàn)為耳廓發(fā)育不全，即正常輪廓缺失，遺留小團(tuán)軟骨塊或皮贅。該類患者的殘耳軟骨取材簡便，不損傷正常生理結(jié)構(gòu)，在基于組織工程技術(shù)的耳廓再造中具有重要的應(yīng)用價值。我們在前期研究中已明確體外構(gòu)建成人大小耳廓軟骨所需要的殘耳軟骨細(xì)胞總量、代次及其與表型的關(guān)系。但是，細(xì)胞在體外的生物學(xué)特性會受到體內(nèi)微環(huán)境的影響，體外擴(kuò)增的殘耳軟骨細(xì)胞最終在體內(nèi)的軟骨形成能力仍不清楚。本實驗通過比較第3～8代殘耳軟骨細(xì)胞與材料復(fù)合在體內(nèi)形成的組織工程化軟骨，明確體外傳代對殘耳軟骨細(xì)胞體內(nèi)軟骨形成能力的影響，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)參數(shù)。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，樣本取自3例Ⅲ期耳廓再造術(shù)患者廢棄的殘耳軟骨，患者年齡7～13歲，均已知情同意。

1.2 主要試劑和材料

無紡聚羥基乙酸（PGA，組織工程國家工程中心），聚乳酸（PLA，Sigma 公司，USA），堿性成纖維細(xì)胞生長因子（Peprotech公司，美國），兔抗人Ⅱ型膠原多克隆抗體、三步法免疫組化檢測試劑盒SP-9001、濃縮型DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 殘耳軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)

將殘耳軟骨剝離軟骨膜，切成2 mm×2 mm×2 mm小塊，以0.25%胰蛋白酶消化20min，PBS沖洗3次，0.2%Ⅳ型膠原酶37℃搖床消化8～12 h，200目濾網(wǎng)過濾，2000 r/min離心8min，錐蟲藍(lán)染色檢查細(xì)胞活力并計數(shù)，以 1.5×104cells/cm2的密度接種，加入培養(yǎng)基（10 ng/mL bFGF，DMEM-LG，10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，0.1 mg/mL鏈霉素），置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)，4 d傳代1次。分別收集第3～8代殘耳軟骨細(xì)胞用于組織工程軟骨構(gòu)建。

1.4 生物支架的制備

將PGA均勻嵌入預(yù)制的圓柱狀（直徑5 mm，厚度1.5 mm）硅膠模具內(nèi)，滴加0.1%的聚乳酸（Polylactic acid，PLA）二氯甲烷溶液約 50μL，自然干燥后，75%乙醇消毒，PBS洗滌3次，培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)過夜，準(zhǔn)備接種細(xì)胞。

1.5 細(xì)胞-支架復(fù)合物的體外培養(yǎng)和體內(nèi)植入

收集第3～8代細(xì)胞，分別以6.0×107cells/mL濃度接種至PGA/PLA支架材料。根據(jù)細(xì)胞代次設(shè)為6組（n=10），以普通培養(yǎng)基培養(yǎng)（DMEM-LG，10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素，0.1 mg/mL 鏈霉素），1 周換液3次；體外培養(yǎng)4周后，部分取材行軟骨相關(guān)檢測，其余的植入裸鼠體內(nèi)觀察8周。

1.6 相關(guān)檢測

1.6.1 大體觀察

觀察各代細(xì)胞-材料復(fù)合物在體外培養(yǎng)4周后及植入體內(nèi)8周后的大小、形狀、質(zhì)地和色澤。

1.6.2 組織學(xué)檢測

對各組標(biāo)本進(jìn)行HE、番紅O、維多利亞藍(lán)染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色。

1.6.3 Real-time PCR檢測

留取體外培養(yǎng)4周各代復(fù)合物標(biāo)本進(jìn)行總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和Real-time PCR反應(yīng)，檢測的基因、引物序列如下所示。GAPDH：5'-CGTCAAAGGTGGAGGAGTG-3'，5'-GAAGCTCACTGGCATGGC-3'；COL2A1：5'-AGGTCACAGAGGTTATCCAG-3'，5'-GTCCGTCCTCTTTCACCAG-3'；SOX9：5'-TCTACACACAGCTCAC-3'，5'-TGGGTTCGAGTTGCCTTTAG-3'；DLK1：5'-CGAGCACCGTATCCTGAAG-3'， 5'-AGGATGGTAAAGCAGATGGC-3'。

1.6.4 生物力學(xué)檢測

對體內(nèi)8周的各組標(biāo)本進(jìn)行彈性模量檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計，應(yīng)用One way-ANOVA進(jìn)行分析，P<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)4周

2.1.1 大體及組織學(xué)

第3～8代細(xì)胞-支架復(fù)合物均未形成基質(zhì)飽滿的類軟骨組織。復(fù)合物接種后的早期生長階段，僅有少量新生基質(zhì)分泌，且隨代次的增高，細(xì)胞-材料復(fù)合物的新生基質(zhì)越疏松（圖 1，A～F）。

HE染色結(jié)果與大體表現(xiàn)吻合，只見細(xì)胞與稀少的新生基質(zhì)，以及大量未降解的PGA纖維（圖1，A1～F1）。番紅O染色結(jié)果僅表現(xiàn)為淡染的紅色背景（圖1，A2～F2）。Ⅱ型膠原免疫組化染色結(jié)果與番紅O 染色結(jié)果一致（圖 1，A3～F3）。

2.1.2 軟骨相關(guān)基因的表達(dá)

第3～8代復(fù)合物體外培養(yǎng)4周后，COL 2A1的表達(dá)水平在第5代后明顯下調(diào)（P<0.05）（圖2，A）。SOX 9在第3、4代的表達(dá)水平顯著高于第5～8代（P<0.05）（圖 2，B）。 DLK 1 的檢測結(jié)果與 SOX 9 相似，第3、4代殘耳軟骨細(xì)胞構(gòu)建的組織中DLK 1維持較高水平的表達(dá)，但只在第3代和其他代次之間檢測到統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）（圖 2，C）。

2.2 體內(nèi)植入8周

2.2.1 大體及組織學(xué)

第3～6代細(xì)胞-支架復(fù)合物經(jīng)體內(nèi)8周重塑后，形成了與原支架等大的類軟骨組織，色微黃且觸之有彈性（圖3，A～D），而第7、8代殘耳軟骨細(xì)胞構(gòu)建的復(fù)合物萎縮成一小團(tuán)纖維組織（圖3，E～F）。

HE染色結(jié)果顯示，第3～6代殘耳軟骨細(xì)胞構(gòu)建的復(fù)合物中均能見到典型的軟骨結(jié)構(gòu)，第3、4代復(fù)合物形成的軟骨結(jié)構(gòu)較多（圖 3，A1、B1），隨代次增高軟骨結(jié)構(gòu)減少，纖維組織增多（圖 3，C1、D1），且第7代復(fù)合物中只有極少數(shù)的島狀軟骨形成（圖3，E1），至第 8 代僅有纖維組織（圖 3，F(xiàn)1）。 番紅 O染色結(jié)果示，第3、4代復(fù)合物陽性著色較為均一（圖3，A2、B2），第5～7代細(xì)胞構(gòu)建的復(fù)合物其軟骨結(jié)構(gòu)紅染，纖維組織呈陰性（圖3，C2～E2），第8代的全部組織均呈陰性染色（圖3，F(xiàn)2）。Ⅱ型膠原免疫組化染色和維多利亞藍(lán)染色結(jié)果與番紅O結(jié)果一致（圖3，A3～F3，A4～F4）。

2.2.2 生物力學(xué)性能

體內(nèi)植入8周后，各組復(fù)合物的彈性模量隨代次增加逐漸降低，第3～6代復(fù)合物的彈性模量明顯高于第 7、8 代（P<0.05）（圖 4）。

圖1 各組復(fù)合物體外培養(yǎng)4周大體及組織學(xué)觀察（標(biāo)尺：100 μm）Fig.1 Gross and histological observation of each group after cultured for 4 weeks in vitro(Scale:100 μm)

圖2 各組復(fù)合物體外培養(yǎng)4周后軟骨相關(guān)基因的表達(dá)Fig.2 The expression of chondrocyte specific genes in each group after cultured for 4 weeks in vitro

圖3 各組復(fù)合物體內(nèi)植入8周后大體及組織學(xué)觀察（標(biāo)尺：100 μm）Fig.3 Gross and histological observation of each group after cultured for 8 weeks in vivo(Scale:100 μm)

圖4 各組復(fù)合物體內(nèi)培養(yǎng)8周后的彈性模量（*：P<0.05）Fig.4 The elastic modulus in each group after cultured for 8 weeks in vivo(*:P<0.05)

3 討論

殘耳軟骨細(xì)胞是耳廓軟骨組織工程極具研究及應(yīng)用價值的種子細(xì)胞[1-2]。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，殘耳軟骨細(xì)胞和正常耳軟骨細(xì)胞一樣在體外傳代過程中極易發(fā)生去分化，細(xì)胞傳至第3代時軟骨表型已十分微弱，到第4代已基本消失。衡量軟骨細(xì)胞臨床意義的重要指標(biāo)是體內(nèi)的成軟骨能力。因此，本實驗將殘耳軟骨細(xì)胞從第3代連續(xù)擴(kuò)增至第8代，將各代細(xì)胞分別接種于PGA/PLA三維支架上，在體外培養(yǎng)4周后植入體內(nèi)，研究傳代對殘耳軟骨細(xì)胞體內(nèi)成軟骨能力的影響。我們發(fā)現(xiàn)，雖然第3～8代細(xì)胞-材料復(fù)合物在體外培養(yǎng)4周后均不能形成軟骨組織，但植入體內(nèi)8周后，第3～6代復(fù)合物均有不同程度的軟骨結(jié)構(gòu)形成，說明適當(dāng)?shù)奈h(huán)境的確能改善軟骨細(xì)胞的去分化現(xiàn)象[3-6]。

雖然體外4周時，各組在組織學(xué)水平上未能形成典型的軟骨結(jié)構(gòu)，但軟骨轉(zhuǎn)錄因子SOX 9在第3、4代顯著高于其他代次。DLK 1是決定細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因，并與軟骨分化關(guān)系密切[7-9]。Harkness[10]證實，DLK 1可作為有軟骨分化潛能的軟骨祖細(xì)胞的標(biāo)記。我們檢測了DLK 1在不同代次細(xì)胞-材料復(fù)合物中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其與SOX 9表達(dá)基本一致，在第3、4代中表達(dá)水平較高。另外，體內(nèi)重塑8周后，組織學(xué)染色可見第3、4代復(fù)合物中均有大量軟骨結(jié)構(gòu)形成，且隨代次增高而減少，纖維組織逐漸增多。我們推測，SOX 9和DLK 1可作為檢測傳代過程中軟骨細(xì)胞是否保留體內(nèi)成軟骨潛能的標(biāo)志分子。此外，第3～6代軟骨組織的彈性模量顯著高于第7、8代復(fù)合物，說明即使組織中混雜不同程度的纖維組織，但只要有一定量的軟骨結(jié)構(gòu)，整個組織便可維持一定水平的生物力學(xué)特性。

綜上所述，我們認(rèn)為殘耳軟骨細(xì)胞體外擴(kuò)增至第4代時，仍能保持良好的體內(nèi)成軟骨能力；第7、8代殘耳軟骨細(xì)胞復(fù)合物在體內(nèi)8周后只形成了纖維組織，表明軟骨細(xì)胞已喪失了成軟骨能力，提示擴(kuò)增傳代對殘耳軟骨細(xì)胞軟骨表型去分化的影響在第7代后已無法逆轉(zhuǎn)。

[1]Kamil SH,Vacanti MP,Vacanti CA,et al.Microtia chondrocytes as a donor source for tissue-engineered cartilage[J].Laryngoscope,2004,114(12):2187-2190.

[2]Yanaga H,Imai K,Fujimoto T,et al.Generating ears from cultured autologous auricular chondrocytes by using two-stage implantation in treatment of microtia[J].Plast Reconstr Surg,2009,124(3):817-825.

[3]Chen GP,Takashi S,Takashi U,et al.Redifferentiation of dedifferentiated bovine chondrocytes when cultured in vitro in a PLGA-collagen hybrid mesh[J].FEBS Letters,2003,542(1-3):95-99.

[4]Ando K,Imai S,Isoya E,et al.Effect of dynamic compressive loading and its combination with a growth factor on the chondrocytic phenotype of 3-dimensional scaffold-embedded chondrocytes[J].Acta Orthop,2009,80(6):724-733.

[5]Caron MM,Emans PJ,Coolsen MM,et al.Redifferentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes:comparison of 2D and 3D cultures[J].Osteoarthritis Cartilage,2012,20(10):1170-1178.

[6]Schuh E,Hofmann S,Stok K,et al.Chondrocyte redifferentiation in 3D:the effect of adhesion site density and substrate elasticity[J].J Biomed Mater Res A,2012,100(1):38-47.

[7]Wang Y,Sul HS.Pref-1 regulates mesenchymal cell commitment and differentiation through Sox9[J].Cell Metab,2009,9(3):287-302.

[8]Taipaleenmaki H,Harkness L,Chen L,et al.The crosstalk between transforming growth factor-beta1 and delta like-1 mediates early chondrogenesis during embryonic endochondral ossification[J].Stem Cells,2012,30(2):304-313.

[9]Chen L,Qanie D,Jafari A,et al.Delta-like 1/fetal antigen-1(Dlk1/FA1)is a novel regulator of chondrogenic cell differentiation via inhibition of the Akt kinase-dependent pathway[J].J Biol Chem,2011,286(37):32140-32149.

[10]Harkness L,Taipaleenmaki H,Mahmood A,et al.Isolation and differentiation of chondrocytic cells derived from human embryonic stem cells using dlk1/FA1 as a novel surface marker[J].Stem Cell Rev,2009,5(4):353-368.