常會(huì)敏 高天喜 王正輝 盧曉云 吳寶俊 張向紅

PhaP-RGD融合蛋白修飾的PHBHHx與人鼻中隔軟骨細(xì)胞的生物相容性研究

常會(huì)敏 高天喜 王正輝 盧曉云 吳寶俊 張向紅

目的觀察經(jīng)PhaP-RGD融合蛋白修飾的3-羥基丁酸和3-羥基己酸的共聚酯（PHBHHx）生物材料與人鼻中隔軟骨細(xì)胞的生物相容性。方法體外培養(yǎng)人鼻中隔軟骨細(xì)胞，接種于經(jīng)PhaP-RGD融合蛋白修飾的PHBHHx膜性材料上進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過MTT比色法、DAPI染色、掃描電鏡、甲苯胺藍(lán)染色等實(shí)驗(yàn)方法觀察在體外條件下生物修飾后的PHBHHx膜與鼻中隔軟骨細(xì)胞的生物相容性。結(jié)果經(jīng)PhaP-RGD融合蛋白修飾的PHBHHx膜表面接觸角變小，親水性增加；人鼻中隔軟骨細(xì)胞在蛋白修飾后的生物膜材料表面能保持較高的增殖率；經(jīng)蛋白修飾的PHBHHx膜表面的軟骨細(xì)胞活力明顯高于細(xì)胞培養(yǎng)板及未經(jīng)蛋白修飾的PHBHHx膜上的軟骨細(xì)胞；甲苯氨藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)經(jīng)PhaP-RGD修飾的PHBHHx膜能促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌胞外基質(zhì)糖胺多糖。結(jié)論經(jīng)PhaP-RGD融合蛋白修飾的PHBHHx與軟骨細(xì)胞的生物相容性良好，是一種較理想的軟骨組織工程支架材料。

PhaP-RGD融合蛋白3-羥基丁酸與3-羥基己酸共聚酯人鼻中隔軟骨細(xì)胞組織工程

由于軟骨細(xì)胞的自我修復(fù)能力有限，因外傷、炎癥或先天畸形造成的耳、鼻、咽喉或氣管部的軟骨損傷修復(fù)一直是臨床亟待解決的難題。組織工程學(xué)的研究進(jìn)展為頭頸部缺損軟骨的修復(fù)展示了美好的前景。人鼻中隔軟骨細(xì)胞屬透明軟骨，較易獲得，且3代以內(nèi)軟骨細(xì)胞特性維持良好，適合作為組織工程軟骨修復(fù)的種子細(xì)胞。3-羥基丁酸與3-羥基己酸共聚酯（PHBHHx）是第三代PHA，是存在于微生物細(xì)胞中的一種天然生物材料，由大量微生物在不平衡條件下發(fā)酵產(chǎn)生，具有良好的生物相容性和生物降解性，具備一定的機(jī)械強(qiáng)度，有良好的熱可塑性[1]。PhaP是存在于PHA表面的一種PHA顆粒結(jié)合蛋白，是一種小分子兩性蛋白質(zhì)。RGD肽被研究證明是能提高細(xì)胞與生物材料黏連的有效肽序列[2－3]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，利用蛋白工程技術(shù)表達(dá)純化的PhaP-RGD融合蛋白，對(duì)PHBHHx三維支架材料進(jìn)行生物修飾后，能夠增加材料表面的親水性，促進(jìn)細(xì)胞與材料之間的貼附，并能促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞方向的分化[4]。

本實(shí)驗(yàn)將人鼻中隔軟骨細(xì)胞置于經(jīng)PhaP-RGD融合蛋白修飾后的PHBHHx生物膜上進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，探討PhaP-RGD融合蛋白對(duì)PHBHHx親水性的改變，及其對(duì)PHBHHx與軟骨細(xì)胞生物相容性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

鼻中隔軟骨細(xì)胞取自人鼻內(nèi)鏡術(shù)后廢棄的軟骨組織。PHBHHx（清華大學(xué)陳國(guó)教授提供），PHBHHx生物膜由本課題組制作。PhaP-RGD融合蛋白由本課題組進(jìn)行表達(dá)、純化。

1.2 方法

1.2.1 人鼻中隔軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)

取功能性鼻內(nèi)鏡術(shù)后廢棄的軟骨（經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意），剝除軟骨表面的筋膜，應(yīng)用“三步消化法”消化；消化停止后經(jīng)篩網(wǎng)過濾后離心去上清，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。48 h后更換培養(yǎng)液，以后每2天換液1次。細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)90%后，0.5%胰酶消化，按1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 PhaP-RGD融合蛋白的表達(dá)純化

通過重組大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)PhaP-RGD融合蛋白，即取含有重組基因PhaP-RGD質(zhì)粒的E. coli BL21(DE3)100μL接種到10 mL LB培養(yǎng)基（氨芐青霉素濃度5 mg/mL）中，恒溫?fù)u床37℃培養(yǎng)12 h；之后加入100μL 24 mg/mL ITPG繼續(xù)培養(yǎng)5 h，誘導(dǎo)菌種表達(dá)融合蛋白。驗(yàn)證融合蛋白的表達(dá)后，使用Takara公司的鎳柱純化試劑盒純化目標(biāo)蛋白，并通過SDS-PAGE和Western blot進(jìn)行驗(yàn)證。以不含質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)為對(duì)照（不加氨芐和誘導(dǎo)劑）。

1.2.3 PHBHHx膜性材料的制備

利用溶劑揮發(fā)法制備PHBHHx生物膜材料。稱取5 g PHBHHx，溶解于100 mL CHCl3中，蓋上保鮮膜，60℃水浴加熱1 h助溶；將充分溶解的材料均勻鋪至10個(gè)9 cm直徑玻璃培養(yǎng)板中；蓋上保鮮膜防止灰塵落入，針頭扎孔使其自然揮發(fā)，24～48 h后可得到PHBHHx膜。

1.2.4 PhaP-RGD融合蛋白的修飾

將PHBHHx膜浸泡在濃度為3.5 mg/mL的PhaP-RGD純化蛋白液中，4℃孵育過夜。用PBS沖洗掉膜表面未結(jié)合的蛋白。

1.2.5 接觸角測(cè)量PHBHHx膜表面接觸角改變

接觸角測(cè)量實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（未處理）和PhaPRGD蛋白處理組。將PHBHHx膜裁剪成小塊，按上述分組并進(jìn)行相應(yīng)處理；處理過的膜表面用純水沖洗，測(cè)量接觸角之前膜表面的水分用濾紙吸干；將各組膜用雙面膠固定在接觸角測(cè)量?jī)x的樣品臺(tái)上，在膜表面滴加10μL純水，選擇適當(dāng)?shù)臏y(cè)量區(qū)域測(cè)量并拍照。根據(jù)測(cè)量數(shù)值計(jì)算各組接觸角。

1.2.6 人鼻中隔軟骨細(xì)胞種植于PHBHHx膜

未修飾的PHBHHx膜于細(xì)胞培養(yǎng)前，以75%乙醇浸泡過夜，紫外照射正反面各1 h，PBS洗3遍。經(jīng)PhaP-RGD融合蛋白修飾過的PHBHHx膜，經(jīng)PBS洗3遍后用于細(xì)胞培養(yǎng)。48孔培養(yǎng)板中，軟骨細(xì)胞以2×107cells/cm2的密度接種于兩種PHBHHx膜上，以細(xì)胞培養(yǎng)板作為對(duì)照，每組3個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng)3 d和7 d。

1.2.7 細(xì)胞增殖與活力的測(cè)定

體外培養(yǎng)3 d，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS漂洗3次；DAPI染色5 min，PBS緩沖液漂洗3次；在洗凈的玻片上滴加2μL的滅菌甘油，使兩種PHBHHx膜固定在玻片上；倒置顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞在生物膜上的增殖情況。

取培養(yǎng)3 d和7 d的細(xì)胞板；每孔加入200μL MTT溶液（0.5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h，棄去培養(yǎng)基；將孔板中PHBHHx膜迅速移至新的48孔板內(nèi)，長(zhǎng)有細(xì)胞的一面朝上；每孔加入200μL DMSO置搖床上震蕩10 min，將每孔中液體加入標(biāo)記好的96孔板中，每孔150μL，酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm波長(zhǎng)時(shí)的A值，進(jìn)行細(xì)胞活力分析。

1.2.8 甲苯胺藍(lán)染色觀察

體外培養(yǎng)7 d后，PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定于6孔板中1 h或更長(zhǎng)時(shí)間（4℃）；自來水洗5 min，蒸餾水洗5 min；加1%甲苯胺藍(lán)浸染2 h；去除多余染液，鏡下觀察。

1.2.9 掃描電鏡觀察

體外培養(yǎng)的細(xì)胞，經(jīng)過樣本的制備，噴金處理后，在掃描電鏡下觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人鼻中隔軟骨細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)特性

相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，原代軟骨細(xì)胞呈圓形，折光性較強(qiáng)（圖1-A）；需2 d完成貼壁過程（圖1-B）；第3天細(xì)胞出現(xiàn)伸展，開始時(shí)為梭形，后呈不規(guī)則三角形或多角形，胞漿中有圓形致密顆粒（圖1-C）。

2.2 表達(dá)、純化PhaP-RGD融合蛋白

在驗(yàn)證目的蛋白正確的基礎(chǔ)上，根據(jù)目標(biāo)蛋白開頭含His-Tag組氨酸標(biāo)簽，可以特異性地和鎳吸附的特性，利用鎳柱純化目標(biāo)蛋白，并對(duì)純化的蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western blot驗(yàn)證。結(jié)果顯示，經(jīng)過鎳柱純化后，得到了條帶均一的目標(biāo)融合蛋白溶液（圖2）。

2.3 接觸角測(cè)量

PhaP-RGD融合蛋白與膜材料結(jié)合后測(cè)量其表面水接觸角檢，以檢測(cè)其親水性。結(jié)果顯示，對(duì)照組PHBHHx膜接觸角為98.69°；經(jīng)融合蛋白處理后的PHBHHx膜表面水接觸角為10.63°。表明經(jīng)過融合蛋白的生物修飾作用，材料的表面接觸角明顯變小，證明PhaP-RGD融合蛋白可以增加膜材料表面的親水性（圖3）。

2.4 軟骨細(xì)胞在經(jīng)蛋白修飾后PHBHHx膜表面的活力及增殖情況

采用MTT法對(duì)生長(zhǎng)于經(jīng)PhaP-RGD蛋白修飾PHBHHx膜的軟骨細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)3 d后，經(jīng)修飾后的PHBHHx膜表面生長(zhǎng)的軟骨細(xì)胞活力高于其他兩組。培養(yǎng)7 d后，PHBHHx膜與修飾后PHBHHx膜表面生長(zhǎng)的軟骨細(xì)胞活力顯著高于細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的軟骨細(xì)胞；而修飾后的PHBHHx膜表面的軟骨細(xì)胞活力稍高于PHBHHx膜。表明PHBHHx膜對(duì)軟骨細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性，并且會(huì)增加細(xì)胞的活力；另外，PhaP-RGD融合蛋白能增加PHBHHx膜表面軟骨細(xì)胞的活力（圖4）。

采用DPAI法觀察細(xì)胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞培養(yǎng)板和未經(jīng)處理的PHBHHx膜相比，經(jīng)過蛋白修飾的PHBHHx膜表面細(xì)胞數(shù)目較多（圖5）。

2.5 PHBHHx膜上軟骨細(xì)胞形態(tài)特征

掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，所有膜上的細(xì)胞均表現(xiàn)出軟骨細(xì)胞的正常形態(tài)（圖6-A1、A3），細(xì)胞之間形成連接，開始融合，部分細(xì)胞向膜表面的孔隙內(nèi)生長(zhǎng)，甚至跨越孔隙（圖6-A2、A4）。

2.6 細(xì)胞胞外基質(zhì)分泌情況

甲苯胺藍(lán)染色顯示，在沒有接種細(xì)胞的膜表面未觀察到異染現(xiàn)象（圖7-A）；在PHBHHx膜及經(jīng)蛋白修飾PHBHHx膜表面均可見藍(lán)色異染，經(jīng)蛋白修飾的PHBHHx膜表面較未經(jīng)修飾的PHBHHx染色深（圖7-B、C）。表明經(jīng)PhaP-RGD修飾的PHBHHx膜更能促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌胞外基質(zhì)糖胺多糖。

圖1 原代人鼻中隔軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察（40×）Fig.1 Histological observation of P0 human nasal septal chondrocytes(40×)

圖2 Western blot驗(yàn)證PhaP-RGD融合蛋白的表達(dá)及純化Fig.2 The expression and purification of PhaP-RGD fusion protein

圖3 接觸角測(cè)量Fig.3 The measurement of contact angle

圖4 MTT法測(cè)定各組軟骨細(xì)胞活力（*：P＜0.05）Fig.4 Cell viability of chondrocytes in each group by MTT method(P＜0.05)

圖6 軟骨細(xì)胞在PHBHHx膜與修飾后PHBHHx膜表面培養(yǎng)7 d后的掃描電子顯微鏡觀察Fig.6 SEM observation of chondrocytes on PHBHHx film and modified PHBHHx film cultured

圖7 軟骨細(xì)胞胞外基質(zhì)的分泌情況Fig.7 The secretion of extracellular matrix of chondrocytes

3 討論

頭頸部軟骨自我修復(fù)能力有限，外科手術(shù)治療又存在許多缺陷，因此，該區(qū)域軟骨組織缺損的理想修復(fù)仍是耳鼻咽喉科面臨的難題之一。近年來，軟骨組織工程研究取得了巨大的進(jìn)步，為軟骨缺損修復(fù)展現(xiàn)出美好的前景。軟骨組織工程的一般策略是將細(xì)胞接種于生物材料上，再將這一人工復(fù)合體進(jìn)行移植。理想的用于軟骨移植的支架材料，除了具有無細(xì)胞毒性、生物可降解性、有一定的機(jī)械強(qiáng)度等組織工程對(duì)一般支架材料的要求外，還應(yīng)該滿足以下要求：促進(jìn)軟骨細(xì)胞的存活、增殖，不影響移植軟骨細(xì)胞的活力以及能夠維持軟骨細(xì)胞正常表型[5-10]。PHBHHx因較好的生物相容性，在軟骨組織工程的研究中受到重視。但是，作為高分子生物材料，其表面的強(qiáng)疏水性是一直存在的，因此考慮對(duì)PHBHHx膜進(jìn)行表面修飾[11-14]。紫外線、等離子、臭氧等方法常被用于PHBHHx表面改性，主要是通過在材料表面形成所需的官能團(tuán)，改變表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[15-17]。這些方法或多或少地改變了生物材料原有的性能，限制了生物材料的應(yīng)用。隨著組織工程的日益發(fā)展，對(duì)生物材料的表面修飾提出了更高的要求，特異性識(shí)別修飾引起了人們的注意。細(xì)胞對(duì)生物材料表面的特異性識(shí)別，在組織工程中占據(jù)重要的地位，是細(xì)胞黏附在生物材料表面并進(jìn)行增殖、分化等生理活動(dòng)的基礎(chǔ)，從材料修飾的角度講，在生物材料表面引入能促進(jìn)細(xì)胞特異性識(shí)別的分子或基團(tuán)，無疑是一種修飾的重要途徑[18-19]。眾所周知，RGD肽（細(xì)胞黏附信號(hào)肽）是提高細(xì)胞與生物材料黏連的有效肽序列。有研究將RGD引入PHBV三維支架中[20]，在不干擾原有生物素結(jié)合性能的情況下，提高了材料的細(xì)胞識(shí)別性和生物相容性。另有研究將RGD肽與PHA表面顆粒結(jié)合蛋白PhaP融合，用于生物支架材料的修飾，不僅改善了細(xì)胞相容性，還促進(jìn)細(xì)胞分化，維持細(xì)胞正常形態(tài)[21]。因此，將能結(jié)合材料的PhaP蛋白與能促進(jìn)細(xì)胞黏附的RGD序列融合，并對(duì)高分子材料進(jìn)行修飾是改善材料生物相容性的有效方法。

本實(shí)驗(yàn)將PhaP-RGD融合蛋白結(jié)合到PHBHHx膜表面，接觸角測(cè)量結(jié)果顯示經(jīng)PhaP-RGD修飾的PHBHHx接觸角明顯減小，說明PhaP-RGD能夠促進(jìn)PHBHHx表面的親水性增加。人鼻中隔軟骨細(xì)胞種植于PHBHHx膜上后，體外培養(yǎng)3 d，細(xì)胞均能黏附于PHBHHx膜上，且修飾后的PHBHHx膜表面的軟骨細(xì)胞活力高于PHBHHx膜。說明PHBHHx膜具有良好的細(xì)胞親和性，進(jìn)一步說明了PHBHHx經(jīng)PhaP-RGD修飾后，其疏水性得到較大改善，有利于細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)。7 d后，生長(zhǎng)在PHBHHx膜及經(jīng)蛋白修飾PHBHHx膜上的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，同時(shí)細(xì)胞周圍可見大量細(xì)胞外基質(zhì)，而修飾后的PHBHHx膜表面的軟骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)分泌更多。說明PhaP-RGD能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖，且軟骨細(xì)胞的特性維持良好。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)PhaP-RGD融合蛋白生物修飾的PHBHHx作為人鼻中隔軟骨細(xì)胞移植的支架材料，不僅可以為移植的軟骨細(xì)胞提供物理支撐，維持細(xì)胞正常表型，還使生長(zhǎng)在其表面的軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出更好的細(xì)胞活力。這為生物修飾后的PHBHHx作為軟骨細(xì)胞移植的支架材料提供了有力證據(jù)，有望進(jìn)一步用于體內(nèi)組織工程軟骨修復(fù)的研究。

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Biocompatibility of Human Nasal Septal Chondrocytes on PHBHHx Coated with PhaP-RGD Fusion Peptide

CHANG Huimin1,GAO Tianxi2,WANG Zhenghui2,LU Xiaoyun3,WU Baojun2,ZHANG Xianghong2.1 Department of Otolaryngology,Affiliated Hospital of Xi'an Medical University,Xi'an 710077,China;2 Department of Otolaryngology& Head and Neck Surgery,The Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004,China;3 Xi'an Jiaotong University School of Life Science&Technology,Xi'an 710049,China.Corresponding author:WANG Zhenghui(E-mail: ehui4298@163.com).

ObjectiveTo explore the biocompatibility of PHBHHx biomaterial coated with PhaP-RGD fusion protein on human nasal septal chondrocytes.MethodsThe human nasal septal chondrocytes were cultured and seeded onto the PHBHHx biomaterials modified with PhaP-RGD fusion protein in vitro.The biocompatibility of modified PHBHHx on human nasal septal chondrocytes was detected by MTT assay,DAPI staining,scanning electron microscopy and toluidine blue staining.ResultsThe contact angle of modified PHBHHx was smaller and the surface hydrophilicity increased;The human nasal septal chondrocytes on modified maintained a high proliferation rate.The viability of chondrocytes on modified PHBHHx film was significantly higher than that on PHBHHx film and cell culture plate.It is discovered that PHBHHx film coated with PhaP-RGD can promote the secretion of extracellular matrix of cartilage--glycosaminoglycan by toluidine blue staining.ConclusionPHBHHx coated with PhaP-RGD fusion protein has better biocompatibility on chondrocytes,and is an ideal scaffold material for cartilage tissue engineering.

PhaP-RGD fusion protein;Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate); Human nasal septal chondrocytes;Tissue-engineered cartilage

Q813.1+1

A

1673－0364（2013）06－0319－05

2013年9月16日；

2013年11月5日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.06.005

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81000416）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（西安交通大學(xué)國(guó)際合作類，交叉學(xué)科類）；西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院人才培養(yǎng)基金[RC(XM)201102]；西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院重點(diǎn)項(xiàng)目基金[YJ(ZD)201103]。

710077陜西省西安市西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻喉科（常會(huì)敏）；710004陜西省西安市西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（高天喜，王正輝，吳寶俊，張向紅）；710049陜西省西安市西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（盧曉云）。

王正輝（E-mail：ehui4298@163.com）。