苑 維，金 明★，鄧 輝，潘 琳，劉海丹

（1.中日友好醫(yī)院 眼科，北京100029；2.北京太陽宮社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)站，北京 100028）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病（diabetes millutus，DM）最為常見和嚴重的微血管并發(fā)癥之一，視網(wǎng)膜新生血管形成是致盲的主要病理基礎(chǔ)，形成機制還未完全清楚。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor，PEDF）是目前最重要的血管生成因子和血管抑制因子，在DR中的作用逐漸被人們認識。本研究以鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠為模型，觀察應(yīng)用芪參益氣滴丸對視網(wǎng)膜VEGF和PEDF及其mRNA表達的影響。

1 材料和方法

1.1 動物

SPF級雄性6周齡SD大鼠82只，體重180～220g。購自維通利華實驗動物研究所。許可證號SCXK（京）2006-0009。

1.2 藥物和試劑

鏈脲佐菌素（streptozotozin，STZ：美國Sigma公司出品S0130），購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。芪參益氣滴丸浸膏（國藥準字Z20030139），由天津天士力制藥股份有限公司提供。陽性對照藥物：羥苯磺酸鈣膠囊（國藥準字X20000713）。反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit Perfect Real Time （DRR037A），PCR 擴 增 試 劑 盒（DR001A），購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司。GeneRulerTMLow Rangge DNA Ladder；AGEs隨機引物；一步法抗兔/鼠通用型抗體Ⅱ（VEGF，PEDF）購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3 動物模型的建立

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常組12只，造模組70只。造模前大鼠禁食12h，左下腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素，臨用前用pH=4.4檸檬酸緩沖液（4℃保存）冰浴配制成濃度為1%（W/V）的溶液）按65mg/kg大鼠體重，正常對照組注射同等體積的生理鹽水。72h后取尾靜脈血，用快速血糖儀（羅康全活力型血糖儀）測量血糖。凡非空腹血糖≥16.7mmol/L者即為糖尿病大鼠模型。

1.4分組及給藥

成模1周后血糖仍不低于16.7mmol/L的70只糖尿病大鼠隨機分成對照組20只，模型組20只與芪參益氣滴丸組（簡稱試驗組）30只，并開始給藥。實驗期間自由攝食飲水，實驗期10個月。正常組和模型組喂食普通飼料。對照組：大鼠每日上午9～10時灌胃給羥苯磺酸鈣膠囊1次，給藥劑量為0.2g/kg/d。試驗組大鼠每日上午9～10時灌胃給藥1次，給藥劑量為0.2g/kg/d（db=da×Kb/Ka，K人=0.11，K大鼠=0.71，da為已知人的公斤體重劑量，db為欲換算的動物的公斤體重劑量，Kb、Ka為折算系數(shù)。擬正常50kg體重成人口服芪參益氣滴丸1.5g/d，db=1.5/50×0.71/0.11≈0.2）。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 制備視網(wǎng)膜消化鋪片血管標本

動物處死后及時收集大鼠的部分眼球固定在4%多基甲醛溶液中，制作視網(wǎng)膜消化鋪片血管標本。視網(wǎng)膜鋪片PAS染色。在不同倍數(shù)下分別觀察PAS染色視網(wǎng)膜血管及其血管壁細胞走行、分布及形態(tài)、特點。

1.5.2 制備視網(wǎng)膜切片

眼球置于4%多聚甲醛（4℃，24h）固定，沿角膜緣剪開眼球壁，去除角膜、晶體、玻璃體，余下的眼杯放入固定液中再固定48h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度為3μm。

1.5.3 視網(wǎng)膜切片免疫組織化學染色

石蠟切片脫蠟，梯度酒精水化；流水漂洗5min，PBS洗2次，每次5min；封閉內(nèi)源性過氧化物酶（0.3%H2O2甲醇液）15min；流水沖洗5min；PBS液洗3次，每次5min；每張切片滴加阻斷劑50～100μl作用30min；不洗，滴加一抗（VEGF，PEDF：1：50多抗），濕盒4℃冰箱過夜；PBS液洗3次，每次5min；滴加LSAB二抗，濕盒室溫中90min；PBS液洗3次，每次5min；滴加LSAB三抗，濕盒室溫中90min；PBS液洗3次，每次5min；0.05%DAB-H2O2顯色液3～5min，顯色后PBS液終止，水洗5min；梯級乙醇脫水，風干；DPX封片。

1.5.4 RT-PCR

（1）RNA提取步驟：每2只眼視網(wǎng)膜組織加入1mlTrizol，在玻璃勻漿器中勻漿（冰浴）；轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管；冰上放置勻漿混合物5min，每1ml-Trizol加入0.2ml三氯甲烷；劇烈混合30s后，室溫放置3min；4℃12，000rpm離心10min，可見分層；將上層無色水相轉(zhuǎn)移至一新的離心管中；在吸取的水相中加入0.5ml異丙醇，輕柔混合均勻，室溫靜置10min；4℃12，000rpm離心10min，可見少量RNA沉淀；棄上清，用1ml 75%的乙醇洗滌沉淀2次；4℃7，500g離心沉淀5min，棄上清；空氣中干燥RNA沉淀5～10min；20μl DEPC水溶解RNA沉淀；取2μl溶解后的RNA，用紫外分光光度法測 定RNA純度及濃度；計算總RNA濃度。（2）RNA反轉(zhuǎn)錄步驟：將溶解后的RNA用DEPC水稀釋至濃度為1μg/μl；取5μl稀釋后的RNA溶液于新的0.5ml離心管中；每5μlRNA稀釋液中，分 別 加 入 5×PrimeScriptTMBuffer 4μl，Prime-ScriptTMRT Enzyme MixⅠ1μl，Oligo dT Primer 1μl，ramdom 6mers 1μl，RNase Free dH2O 8μl，PCR總反應(yīng)體積為20μl；將反應(yīng)管置于PCR儀，反轉(zhuǎn)錄37℃反應(yīng)15min，85℃反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)5s，4℃終止反應(yīng)10min；將反轉(zhuǎn)錄完畢所得到的模板DNA，用0.5ml離心管分裝，分裝成4管，每管5μl；-20℃保存，備用；以上操作均在冰上進行。（3）RT-PCR反應(yīng)擴增步驟：將模板DNA用雙蒸水1：5倍稀釋；取稀釋后的模板DNA稀釋液2μl至一新0.5ml離心管中，每2μl模板DNA稀釋液分別加入TaKaRa Taq 0.1μl，10×PCR Buffer（Mg2+Plus）2μl，dNTP Mixture 1.6μl，上、下游引物各0.4μl，ddH2O 13.5μl，PCR反應(yīng)液總體積為20μl（冰?。粚⒎磻?yīng)管置于PCR儀，擴增反應(yīng)94℃預(yù)變性2min后，進入94℃變性30s，退火30s，72℃延伸1min，共32個循環(huán)（β-action 28個循環(huán)），最后72℃充分延伸5min，4℃終止反應(yīng)10min。引物序列為VEGF：F：5’-CAGAAACACGACAAACCCATCC-3’，R：5’ - TAAGCCACTCACACACACAGCC-3’，擴增產(chǎn)物438bp。PEDF：F：5’-GAAAATTGCCCGGTCTACAA-3’，R：5’-GTTGGTAACGTCGCCTTCAT-3’，擴增產(chǎn)物412bp。βactin：F：5’-CCTGTATGCCTCTGGTCGTA-3’，R：5’-CCATCTCTTGCTCGAAGTCT-3’，擴增產(chǎn)物260bp。

1.6 統(tǒng)計學方法

組間均值的比較采用SPSS13.0軟件進行成組設(shè)計資料的t檢驗分析。圖像分析儀由北京中醫(yī)藥大學組胚教研室提供。

表1 實驗300d時各組大鼠血糖水平（mmol/L）

表2 視網(wǎng)膜VEGF、PEDF的表達比較（灰度值：xˉ±s）

表3 視網(wǎng)膜VEGFmRNA、PEDFmRNA的表達（OD值）

2 結(jié)果

2.1 處死大鼠前血糖

表1示，各組中樣本數(shù)不同，因?qū)嶒炦^程中糖尿病大鼠有死亡。

2.2 視網(wǎng)膜消化鋪片形態(tài)學觀察

圖1（見封底）示，正常大鼠視網(wǎng)膜毛細血管分布規(guī)則，走向較直，管徑粗細均勻一致；內(nèi)皮細胞一般位于毛細血管中央部位，核較大，染色較淺，成橢圓形或不規(guī)則形，其長軸多與毛細血管平行；周細胞位于毛細血管管腔外側(cè)，核較小，染色深，多成球形或三角形。糖尿病大鼠視網(wǎng)膜毛細血管網(wǎng)排列紊亂，走向極不規(guī)則，管腔粗細不均、周細胞核明顯固縮、數(shù)目顯著減少，內(nèi)皮細胞明顯增生、部分尚可見無細胞毛細血管、影周細胞等其他早期DR特征性病變。對照組和試驗組的改變較模型組減輕。

2.3 視網(wǎng)膜VEGF的表達

視網(wǎng)膜VEGF表達模型組明顯高于正常組（P＜0.01），試驗組和對照組VEGF表達明顯低于模型組（P＜0.01），試驗組和對照組組間差異不顯著。結(jié)果見表2，圖2（見封底）。

2.4 視網(wǎng)膜PEDF的表達

視網(wǎng)膜PEDF表達模型組明顯低于正常組（P＜0.01），試驗組和對照組PEDF表達明顯高于模型組（P＜0.01），結(jié)果見表2，圖3（見封底）。

2.5 視網(wǎng)膜VEGFmRNA的表達

視網(wǎng)膜VEGF mRNA表達模型組顯著高于對照組（P＜0.01），試驗組和對照組表達顯著低于模型組（P＜0.01），試驗組和對照組組間差異不顯著。結(jié)果見表3。VEGFmRNA各區(qū)表達見圖4。

2.6 視網(wǎng)膜PEDFmRNA的表達

視網(wǎng)膜PEDF mRNA表達模型組明顯低于正常組（P＜0.01），試驗組和對照組表達明顯高于模型組（P＜0.01），結(jié)果見表3。PEDFmRNA各區(qū)表達見圖5。

3 討論

中醫(yī)學認為DR是氣陰兩虛、脈絡(luò)瘀阻所致。研究[1]發(fā)現(xiàn)在病變進程中，陽虛證呈上升趨勢，陰虛證呈下降趨勢，提示氣虛始終存在。痰、濕、瘀作為致病因素及病理產(chǎn)物，具有普遍存在性，在DR的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。血瘀貫穿DR發(fā)生發(fā)展的始終[2]。因此本實驗選用益氣活血的芪參益氣滴丸作為干預(yù)用藥。

本實驗觀察到模型組糖尿病大鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)了毛細血管網(wǎng)排列紊亂、管腔粗細不均、周細胞核明顯固縮、數(shù)目顯著減少、內(nèi)皮細胞明顯增生等DR特征性改變。本實驗發(fā)現(xiàn)芪參益氣滴丸和羥苯磺酸鈣均能減輕糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜微血管損害。羥苯磺酸鈣可降低視網(wǎng)膜毛細血管的高滲透性和毛細血管脆性[3]，延緩DR的進展，為眼科臨床常用的防治DR的藥物。芪參益氣滴丸由黃芪、丹參、三七、降香組成，功用益氣活血。研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖[4]能降低四氧嘧啶導(dǎo)致的糖尿病大鼠血糖水平，增高胰島素水平，減輕內(nèi)皮細胞損傷和功能障礙；臨床上應(yīng)用黃芪治療糖尿病及其并發(fā)癥。丹參對血管內(nèi)皮具有明顯的保護作用[5]。三七不但能止血，還能入血分化血瘀。丹參和三七的復(fù)方制劑已廣泛應(yīng)用于臨床治療DR[6，7]。

VEGF是目前所知最強的促血管內(nèi)皮細胞生長的因子，在DR發(fā)生中起重要作用。糖尿病時視網(wǎng)膜組織缺血缺氧VEGF高表達誘導(dǎo)新生血管形成[8]。VEGF主要作用于內(nèi)皮細胞，增加血管通透性，促進血管生成，增加粘附分子和細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生[9]。有研究[10]顯示，在新生血管形成之前VEGF就已導(dǎo)致血-視網(wǎng)膜屏障損傷。PEDF在人眼組織中廣泛分布，角膜、晶狀體、睫狀體、視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜中均檢測到PEDF的表達[11]。PEDF能夠通過引起有活性的內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡來抑制血管形成作用。PEDF可以抑制廣泛的不同的刺激物所引起的血管形成[12]。在正常眼組織中，VEGF和PEDF之間的平衡如被打破，可能導(dǎo)致新生血管形成。本實驗觀察到，模型組糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達高于正常組，PEDF表達低于正常組。藥物干預(yù)后，芪參益氣滴丸組和羥苯磺酸鈣組糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF和VEGF mRNA表達較模型組降低，PEDF和PEDFmRNA表達較模型組增加，二者組間差異不顯著。因此芪參益氣滴丸對視網(wǎng)膜微血管保護作用可能與改善VEGF和PEDF之間的平衡有關(guān)，但它們在病變過程中的動態(tài)變化及相關(guān)性還有待進一步研究。

[1] 匡麗暉，方穗雄，黃雄飛，等.糖尿病視網(wǎng)膜病變中醫(yī)證候分類的修改意見[J].中國中醫(yī)眼科雜志，2007，17（2）：63-64.

[2] 熊靜，彭清華，吳權(quán)龍，等.益氣養(yǎng)陰活血利水法治療單純性糖尿病視網(wǎng)膜病變臨床研究[J].中國中醫(yī)眼科雜志，2009，19（6）：311-315.

[3] 李峻，田浩明.羥苯磺酸鈣治療非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變的系統(tǒng)評價[J].循證醫(yī)學，2008，13（1）：34-41.

[4] 吳勇，歐陽靜萍，涂淑珍，等.黃芪多糖對糖尿病大鼠內(nèi)皮細胞的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志，2002，29（1）：22-23.

[5] 吳開云，楊亞安，王晨，等.丹參醇提取物對內(nèi)皮細胞VCAM-1和ICAM-1表達的影響[J].解剖學雜志，2005，28（1）：98.

[6] 王軍.復(fù)方血栓通治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的療效分析[J].江西醫(yī)藥，2009，44（7）：709-710.

[7] 鄧輝，金明，苑維，等.復(fù)方丹參滴丸治療早期糖尿病視網(wǎng)膜病變的臨床觀察[J].中國中醫(yī)眼科雜志，2005，15（2）：72-74.

[8] Sydorova M，Lee MS.Vascular endothelial growth factor levels in vitreous and serum of patients with either proliferative diabetic retinopathy or prolife rative vetreoretinopathy[J].Ophthal Imc Res，2005，37（4）：188-190.

[9] Hassan K，Simmi W，Rubenchiki，et al.Effect of erythropairtin therapy on polyneuropathy in predialytic patients[J].J Nephrol，2003，16（1）：121-125.

[10] Alikacem N，Yoshizawa T，Nelson KD，et al.Quantitative MR imaging study of intravitreal sustained release of VEGF in rabbits[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2000，41（6）：1561-1569.

[11] Tonbran TJ，Shivaram SM，Chader GJ，et al.Expression，secretion，and age-related down regulation of pigmentepithe lium-derived factor，a serpin with neurotrophic acivity[J].J Neurosci，1995，15（7）：4992-5003.

[12] Dawson DW，Volpert OV，Gillis P，et al.Pigmentepitheliumderived factor a potent inhibitor of angiogenesis[J].Science，1999，285：245-248.