應(yīng)時，全哲學(xué)

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)與微生物工程系, 上海 200433

皮膚作為人體最大的器官，擁有達(dá)1.8 m2的表面積。皮膚的主要功能是作為物理屏障，保護(hù)機體免受外來生物或有毒物質(zhì)的侵害。同時，皮膚也是人體與外界環(huán)境接觸的場所，因此常駐有各類微生物，包括細(xì)菌、真菌、病毒等。通常這些微生物都是無害的，其中部分微生物還能為人類提供一些機體不具有的重要功能。如一些互生的微生物在皮膚表面廣泛存在，可保護(hù)機體抵抗入侵的病原體；另外，還有一些微生物具有馴化T細(xì)胞的作用，使它們能對相似的入侵病原體作出應(yīng)答[1]。

如果將皮膚看作一個生態(tài)系統(tǒng)，那么它就是由各類微生物和皮膚表面的組織細(xì)胞及各種分泌物、微環(huán)境等共同組成的整體，維持著微生物群落與皮膚表面組織細(xì)胞之間的微妙平衡。這種平衡一旦被打破，可能會引起皮膚病或感染[1-3]。這種擾動既可來自內(nèi)在因素(如皮膚分泌物的組成變化引起某種特定菌群的生長)，也可來自外在因素(如抗生素的使用或護(hù)膚品的涂抹)[1]。為進(jìn)一步理解皮膚的健康、疾病和感染等，需更全面了解皮膚微生物群落的結(jié)構(gòu)特點及其與皮膚組織和環(huán)境的相互關(guān)系。

1 皮膚的結(jié)構(gòu)和生理特性

皮膚的基本組成從內(nèi)到外依次為皮下組織、真皮層和表皮層。從結(jié)構(gòu)上看，表皮層作為皮膚的最外層，表面覆蓋有疏水角質(zhì)層，起主要物理屏障作用，既能抵御外來物的入侵，也能阻止水分和營養(yǎng)的流失[4-6]。皮膚表面大多是清爽、干燥、偏酸性的，但來源于真皮層和皮下組織的毛發(fā)和分泌管能突破表皮層，使不同部位因為分布的腺體和毛囊密度不同以及本身的厚度和褶皺而呈現(xiàn)皮膚表面環(huán)境的差異[7]。

皮膚表面的腺體主要有皮脂腺、大汗腺和小汗腺。皮脂腺主要分布在頭皮、臉、頸部和胸，不分布于手掌和腳掌處。皮脂腺一般伴隨著毛囊出現(xiàn)，分泌的皮脂是各種脂肪的混合物，能為微生物生長提供豐富的營養(yǎng)物，同時也為皮膚提供疏水保護(hù)層，并起潤滑作用。因此，皮脂腺分布較密的地方相對厭氧。小汗腺是主要的汗腺，較多分布在腋窩、手掌和腳掌處；而大汗腺能分泌較濃且呈乳白色的分泌物，多分布在腋窩和生殖器周圍。汗液的pH值通常為中性或微酸性，這也是影響微生物分布的一個因素。

皮膚表面有些部位是半遮蔽的，如腹股溝、腋窩和指縫，有相對較高的溫度和濕度。另一些部位如手臂和腿相對干燥，其表面溫度受環(huán)境影響較大，比其他部位微生物的含量少[1]。

2 皮膚微生物的研究方法

早期的皮膚微生物研究主要采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法來識別和描述微生物群落的組成和多樣性。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)有些微生物因生長條件苛刻而難以分離[8]。因此，傳統(tǒng)方法的偏向性和局限性使研究者難以正確、全面闡明皮膚微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性特點。

隨著16S/18S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分類體系的建立，研究進(jìn)入了以基因水平鑒別和分析微生物群落的階段。16S rRNA基因在所有細(xì)菌和古生菌中都存在，長約1 600 bp，既包含可用于系統(tǒng)分類的高變區(qū)，也包含可用于設(shè)計通用引物的保守區(qū)[9]，所以16S rRNA基因常被應(yīng)用于細(xì)菌的檢測。在真菌檢測方面，因18S rRNA基因具有高保守性，故常用18S rRNA與28S rRNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)[10]。至于病毒，現(xiàn)在還沒有一套統(tǒng)一的檢測方法，一些研究中使用特定病毒類型的相對保守基因進(jìn)行分析[11-13]。

在測序技術(shù)方面，從第1代的Sanger測序法發(fā)展到現(xiàn)在的高通量測序[14,15]，不僅通量得到了提高，同時也減少了測序時間和成本；此外，還全面提升了人們對微生物群落的研究能力?，F(xiàn)在使用較多的Roche/454測序平臺，一次能得到序列長度達(dá)400 bp左右的100萬條序列，且通過序列末端加一小段用于區(qū)分不同樣品的標(biāo)記(barcode)能實現(xiàn)幾百個樣品的混合測序[16]。與此相比，Illumina平臺的通量更高，但得到的序列長度相對較短。因此，具體高通量測序方法的選擇需依據(jù)實驗者的研究目的和實驗設(shè)計來決定。

高通量測序從根本上改變了人們對微生物群落的認(rèn)識，從系統(tǒng)的角度去分析和認(rèn)識皮膚微生物的群落及其功能，而不只是關(guān)注傳統(tǒng)的所謂病原微生物與疾病的關(guān)系。面對數(shù)以萬計的序列結(jié)果，相應(yīng)的多個生物信息軟件已被開發(fā)應(yīng)用，常見的有MOTHUR[17]、WATERS[18]、RDP[19]和QIIME[20]。這些軟件雖各有一些缺陷，但都涵蓋了基本分析框架，并引進(jìn)了許多生態(tài)學(xué)分析的概念，如α、β 多樣性等。

2008年，美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)共同基金提出了建立人類微生物組計劃(Human Microbiome Project，HMP)，共同研究人體5個不同部位(皮膚、鼻孔、口腔、腸道和陰道)的微生物群落特點，并分析其與人類健康和疾病的關(guān)系。該計劃希望通過利用高通量測序技術(shù)得到的大量序列分析結(jié)果，為未來臨床研究微生物與疾病和健康的關(guān)系建立一個基準(zhǔn)[21-24]。

3 健康人群的皮膚微生物

采用純培養(yǎng)方法的研究已發(fā)現(xiàn)皮膚為許多互生菌提供了適宜的生存場所，同時這些健康人體中的互生菌也為宿主提供了直接或間接保護(hù)。直接保護(hù)主要包括分泌細(xì)菌素和有毒代謝產(chǎn)物、誘發(fā)較低的氧化還原電位、競爭營養(yǎng)物質(zhì)和分解入侵菌產(chǎn)生的有毒物質(zhì)等[25]。如表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)能表達(dá)肽鏈內(nèi)切酶，與抗菌肽協(xié)同作用，抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的增殖[26]；一些菌株還能分泌細(xì)菌素，抑制其他有毒的葡萄球菌[27]。間接保護(hù)包括誘導(dǎo)宿主增加抗體分泌、刺激吞噬作用和清除機制的發(fā)生、增強干擾素和細(xì)胞因子產(chǎn)生等[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)能分解脂肪，從而形成脂肪酸來酸化環(huán)境并抑制化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的生長[28]。

采用分子方法的研究目前主要是探索不同個體間微生物群落組成的特點(包括一致性和差異性)，較少開展生理和病理意義上的研究。已有研究顯示，屬放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes) 和變形菌門(Proteobacteria)的微生物是皮膚細(xì)菌的主要菌群，其比例甚至高達(dá)94%[29,30]。雖然皮膚細(xì)菌在門水平呈現(xiàn)較低的多樣性，但種屬水平的多樣性較豐富，且呈現(xiàn)明顯的部位差異。根據(jù)不同部位的生境特點，許多研究者將其分為干性、油性和濕性3種。其中常見的油性部位有前額、背部和鼻翼等，濕性部位有鼻孔、腋窩和指縫等，干性部位有前臂、手掌和臀部等。通常油性部位多樣性最低，干性部位多樣性最高。在油性部位占主導(dǎo)的是丙酸桿菌屬(Propionibacterium)[31]，這與基于純培養(yǎng)方法的研究所得結(jié)論一致，因為皮脂腺密集的部位較適合一些兼性厭氧和嗜脂微生物的生長[32]。濕性部位最多的是葡萄球菌屬和棒狀桿菌屬(Corynebacterium)[31,33]，對大汗腺部位的研究發(fā)現(xiàn)這兩類菌與汗液的臭味密切相關(guān)[34]。在干性部位存在多個種屬的細(xì)菌，未見某種細(xì)菌占主導(dǎo)地位，其中手掌和前臂的細(xì)菌多樣性超過腸道和口腔[33]。

一般而言，同一個人左右對稱部位細(xì)菌群落的差異小于不同人該部位的差異，而后者的差異又小于同一個人不同特征部位之間的差異[31,33]。以往研究表明，部位的生境特點比個體特征更能決定其上的微生物群落分布特征[33,35]。有些不同部位之間的差異很小，如肘窩和膝后窩，恰恰是因為這些部位的生境特點近似[31]。即便如此，同一個人對稱部位的細(xì)菌群落差異依然較大。有研究顯示，同一個體左右前臂共同的種水平分類操作單元(operational taxonomic unit，OTU)數(shù)量平均只占28%[29]，甚至同一個體的左右手只有17%的OTU為共同擁有[30]。

除皮膚不同部位的生理特性如濕度、油脂、pH值等會影響菌群的分布外，作為宿主的個體由于年齡、性別、人種和地域等不同也會影響菌群的分布特點，造成人際間的差異[36]。即使是同一個部位，如前臂在不同人之間所共有的OTU數(shù)量只占2%[29]?？傮w來看，油性部位如鼻翼、后背和胸口的人際間差異最小[31]。另外，皮膚本身也會隨著人年齡增長而不斷變化，自然會改變其上的微生物群落結(jié)構(gòu)[37]。通常子宮內(nèi)的胎兒皮膚是無菌的，而一旦出生，無論是順產(chǎn)還是剖宮產(chǎn)，初生兒的皮膚馬上會有微生物定居[38]，且在出生的頭1年其皮膚微生物的多樣性會隨著年齡而增加[39]。在青春期，皮脂含量的改變也會影響皮膚嗜脂菌的含量[1]。男女由于生理結(jié)構(gòu)的差異造成皮膚汗腺、皮脂腺及激素分泌的差異，因而在一定程度上也會影響皮膚微生物的分布[30,40]。至于人種的差異，有研究表明，與黑種人相比，白種人鼻上更易駐存金黃色葡萄球菌，同時白種人也更易被鏈球菌感染[41]。地域不同導(dǎo)致環(huán)境氣候不同，也會影響皮膚的狀況及微生物群落。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，委內(nèi)瑞拉一村莊里的印第安人與美國本土居民在微生物群落結(jié)構(gòu)上存在差異，當(dāng)然這種不同可能是由多種因素造成的[42]。

人體的外部影響，如職業(yè)、衣著、藥物和清潔用品也會改變微生物的群落結(jié)構(gòu)[43]。藥物如抗生素的使用，可能會抑制一些常見菌種而增加其他菌的數(shù)量[44]。同樣，清潔用品的使用也會去除一些暫駐菌群，減少常駐菌群的數(shù)量[30]，但具體機制與效果還不明確。

顯然，健康人體的皮膚微生物并不是一成不變的。比較同一部位微生物群落的變化特點時發(fā)現(xiàn)，隨時間流逝，群落結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定的部位是外耳道、鼻和腹股溝[31]，這些部位都是半遮蔽的。一般而言，似乎多樣性越高的部位群落結(jié)構(gòu)越不穩(wěn)定，包括前臂、膝后窩、肘窩、腳后掌和指縫[31]。

相對于細(xì)菌而言，目前應(yīng)用于皮膚真核微生物群落分析的分子生物學(xué)方法還不夠完善。大部分使用分子生物學(xué)方法檢測到的皮膚真菌主要是馬拉色菌屬(Malassezia)，與純培養(yǎng)的結(jié)果基本一致[45-47]。另外一些純培養(yǎng)方法發(fā)現(xiàn)的皮膚真菌如德巴利酵母屬(Debaryomyces)和隱球菌屬(Cryptococcus)，用分子生物學(xué)方法卻未檢測到[1]。有報道稱馬拉色菌占所有皮膚真菌總數(shù)的53%～80%，在耳翼后含量最高[47]。對人體皮膚其他真菌的組成，目前還不清楚，需進(jìn)一步研究。

針對皮膚微生物群落中的病毒，仍缺乏一套完善的分離及識別方法。目前已發(fā)現(xiàn)的常見皮膚病毒有人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)[48-50]。近期通過DNA病毒的高通量測序發(fā)現(xiàn)了皮膚病毒的高多樣性，并檢測到多瘤病毒、乳頭瘤病毒和圓環(huán)病毒等[51]。病毒也是皮膚微生物生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，需開發(fā)更多的分析手段來進(jìn)行皮膚上病毒組成的相關(guān)研究。

4 皮膚微生物與疾病

從最初臨床使用抗菌藥物治療疾病的思路來看，人們總希望找到特定微生物感染與疾病的對應(yīng)關(guān)系。但分子生物學(xué)技術(shù)能檢測到更具多樣性的微生物群落，一些原本在傷口處通過純培養(yǎng)方法得到的特定“致病”菌，如今卻發(fā)現(xiàn)其并不是傷口處僅有的，如糖尿病并發(fā)癥足潰瘍和下肢靜脈性潰瘍引起的傷口[52-54]。這些菌雖不是引起傷口的病原體，但促進(jìn)了炎癥和傷口的持久不愈合。在一項小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，患處的微生物群落結(jié)構(gòu)會隨傷口的惡化而發(fā)生改變[55]。而燒傷傷口處的情況相反，即依然易檢測到引起感染的特定菌，通常是化膿性鏈球菌、腸球菌(Enterococcus) 或銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)等，也有一些真菌或病毒[56]。這都提示人們需從更加全面的角度來探索疾病與微生物群落的關(guān)系。

對于許多疾病，分子生物學(xué)方法檢測往往能發(fā)現(xiàn)患病部位的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。一項對銀屑病的研究發(fā)現(xiàn)，與健康人的相同部位相比，患病部位的微生物群落多樣性往往更高，且伴隨葡萄球菌增加和痤瘡丙酸桿菌減少[57]。

另外，對一些人們最初認(rèn)定的入侵暫駐菌如金黃色葡萄球菌，如今卻發(fā)現(xiàn)其是人體皮膚的常駐互生菌群[58,59]。同樣的還有脂溢性皮炎，研究發(fā)現(xiàn)馬拉色菌是引起該病的原因，并從機制上得到解釋[60,61]；但后來發(fā)現(xiàn)在健康人皮膚中也存在大量馬拉色菌，并沒有引起脂溢性皮炎。還有與青春期痤瘡密切相關(guān)的痤瘡丙酸桿菌也是人體常見的互生菌，它在青春期會隨皮脂分泌增多而大量繁殖，并分泌脂肪酶、蛋白酶和透明質(zhì)酸酶，破壞組織并進(jìn)入毛囊皮脂腺而引起感染[62,63]。

人們還注意到，一些菌的存在有助于其他潛在致病菌的大量繁殖，引起疾病，這暗示微生物之間相互作用的重要性[3]。如通過繃帶將局部皮膚密封，會使一些厭氧或兼性厭氧的潛在致病菌(如金黃色葡萄球菌)過量繁殖，從而引發(fā)疾病[64]。還有一項有意思的發(fā)現(xiàn)，即一些皮膚的細(xì)菌能作用于分泌的汗液從而散發(fā)出氣味，誘使一種傳播瘧疾的蚊子叮咬人體[65,66]。對互生菌與潛在致病菌相互作用的了解，也正隨著對皮膚微生物研究的深入而加深，但至今仍未在微生物群落層面得到充分解釋。

隨著研究的深入，人們意識到皮膚微生物群落可能發(fā)生轉(zhuǎn)變而成為疾病的一個誘因；但這并不意味著致病菌的獲得或皮膚表面污染就會引起疾病，或洗手就能直接預(yù)防疾病、使用抗生素就能消除疾病。這些行為引起的病原微生物量的改變都會被個體微生物群落中的常駐微生物稀釋、中和而達(dá)到平衡。因此從某種意義上說，針對這種群落結(jié)構(gòu)的調(diào)整是否能引發(fā)宿主的免疫反應(yīng)才是導(dǎo)致疾病的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，皮膚微生物面對突發(fā)的炎癥能引發(fā)免疫反應(yīng)，從而起到有效的控制作用，這為兩者與疾病的關(guān)系提供了印證[67]。在類似的許多疾病如痤瘡、特異性皮炎和牛皮癬等中，都發(fā)現(xiàn)常駐微生物群落發(fā)生變化[57,68,69]。因此，將來的研究要進(jìn)一步關(guān)注常駐微生物群落的變化及其產(chǎn)生的后果，這有助于對疾病和健康的理解。

5 皮膚微生物群落研究的其他應(yīng)用

皮膚微生物對疾病的產(chǎn)生和抑制可能有一定貢獻(xiàn)。因此，一味地使用抗生素在減少有害菌的同時也會減少一些有益菌。人們在使用益生菌治療某些疾病時發(fā)現(xiàn)，益生元能有選擇地平衡皮膚微生物群落組成，即在減少有害菌的同時保護(hù)一些有益菌[70]。在腸道微生物的研究中發(fā)現(xiàn)常見的益生菌(乳酸菌)能有效調(diào)整腸道免疫功能[71]。類似地，在給患有特異性皮炎的嬰兒服用含益生菌的飲食后發(fā)現(xiàn)癥狀顯著改善[72-74]。同時還有研究發(fā)現(xiàn),口服益生菌對健康人可有效幫助皮膚免疫系統(tǒng)免受紫外線的傷害[71]和減少表皮水分流失[75]。益生菌的局部使用較少，但有研究證實絲狀透明顫菌(Vitreoscillafiliformis)能改善脂溢性皮炎和特應(yīng)性濕疹的癥狀[76,77]。這些為皮膚疾病的治療提供了新思路，但需要更多研究確認(rèn)。

皮膚微生物的研究也為清潔產(chǎn)品的開發(fā)提供了新的觀念：并不是一味減少微生物的含量就會健康，還需考慮維持皮膚微生物群落的平衡，以及保護(hù)那些有益的菌群。

還有一個很有趣的應(yīng)用是在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的嘗試。由于皮膚表面的微生物可通過觸摸傳遞到物體上[78]，且能在環(huán)境中保持較長的時間[79]，這為其在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了可能。最近研究發(fā)現(xiàn)，皮膚微生物具有較高的個體部位特異性[29-31,33]。另外，皮膚微生物群落在時間上具有一定的穩(wěn)定性，手掌表面的微生物在洗手后的數(shù)小時就能恢復(fù)[30]，這種穩(wěn)定性的平均時間長達(dá)數(shù)個月[31,33]。有研究嘗試通過采集幾組鍵盤和使用者手指上的微生物群落，發(fā)現(xiàn)兩者具有高度對應(yīng)性，即使將鍵盤放置2周后仍具有對應(yīng)性[80]。當(dāng)然，將其落實到實際的偵破工作中還需更多的檢驗。

6 結(jié)語

由于人體皮膚微生物群落的研究尚處于起步階段，相關(guān)進(jìn)展比較緩慢，因此對其生理和病理意義方面的研究并不多。分子生物學(xué)方法的應(yīng)用使人們對皮膚微生物群落有了更全面的認(rèn)識，但還有很多新的問題有待解決，需更多地從生態(tài)學(xué)的角度去研究微生物群落與宿主和疾病之間的關(guān)系。已有的研究顯示，皮膚的微生物群落具有一定的個體差異性，時間上具有一定的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，同時也存在作為核心微生物組的常駐微生物群體。提示對微生物群落的多樣性需從不同的層次來考察：微生物群落水平、個體水平和人群水平，而不能局限在某種特定的微生物與宿主和疾病的聯(lián)系。因此，對這些微生物不能簡單區(qū)分為致病菌或潛在致病菌、無害或有益的互生微生物，其對疾病的產(chǎn)生和抑制都可能有一定貢獻(xiàn)，需從更全面的角度來考察具體機制。

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