施旭駿，王晴嵐，高謙

復旦大學上海醫(yī)學院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學分子病毒學重點實驗室, 上海 200032

當細菌進入人體后，巨噬細胞、中性粒細胞、樹突細胞等吞噬細胞能對細菌進行吞噬，形成吞噬體，并對細菌進行殺傷。這一過程中，吞噬體內(nèi)的pH值不是一成不變的。相反，它在每一階段都受到系統(tǒng)及有序的控制，不僅影響吞噬體的成熟過程，還是吞噬體發(fā)揮殺菌作用的重要決定因素。

對于許多細菌來說，吞噬體內(nèi)的酸性環(huán)境是極不利于其生存的。為了更好地適應環(huán)境，細菌往往具有一定程度的耐酸能力。更重要的是，那些能阻礙吞噬體酸化的細菌往往表現(xiàn)出更強的毒力。耐酸現(xiàn)象在腸道致病菌如大腸埃希菌、幽門螺桿菌、霍亂弧菌中已有廣泛研究，因為這些細菌會遇到胃部強酸性(pH 2～3)環(huán)境。但對結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)是如何在吞噬體或吞噬溶酶體的酸性環(huán)境中生存的，目前還知之甚少。因此，進一步闡明吞噬體的酸化機制及細菌耐酸機制將有助于更好地理解細菌的致病性。

本文主要對吞噬體的酸化作用及結(jié)核分枝桿菌適應宿主吞噬體內(nèi)酸性環(huán)境的相關(guān)機制作一綜述。

1 吞噬體的酸化作用

結(jié)核分枝桿菌進入人體后，通過表面受體(如Fcγ R和CR3)識別與胞吞作用進入巨噬細胞，并聚集在吞噬體中。在靜息的巨噬細胞中，由于吞噬體還沒有與溶酶體融合，內(nèi)部環(huán)境為弱酸性，pH值在6.2左右。當巨噬細胞被γ 干擾素(interferon γ ，IFN-γ )激活后，含有結(jié)核分枝桿菌的吞噬體逐步與早期內(nèi)體、晚期內(nèi)體、溶酶體融合而成熟為吞噬溶酶體。在不斷融合、成熟過程中，溶酶體中含有的多種蛋白水解酶被激活，可降解包括細菌在內(nèi)的大分子物質(zhì)。同時，吞噬體內(nèi)環(huán)境逐漸酸化，pH值從約6.2降至約5.5，最后至約4.5[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)核分枝桿菌與人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)共感染患者中，吞噬體不能成熟、酸化，可能是由于其體內(nèi)IFN-γ 水平較低，不能激活巨噬細胞[2]。由此可見IFN-γ 在酸化過程中是必需的。吞噬體酸化不僅是囊泡融合的結(jié)果，還會影響囊泡轉(zhuǎn)運和吞噬體成熟過程。研究發(fā)現(xiàn)，吞噬體酸化是聚集包被蛋白I(coatomer protein I，COPI)復合體及募集ADP核糖基化因子6(ADP ribosylation factor 6，ARF6)和細胞附著蛋白(cytohesin)2的必要條件[3]。

參與酸化作用的主要是囊泡ATP酶(vacuolar ATPase，V-ATPase)，它由V0和V1復合體組成。膜內(nèi)的V1復合體能水解ATP，將產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)移給膜上的V0復合體，后者將質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運至吞噬體內(nèi)[4]。酸化的吞噬體環(huán)境不利于細菌生長，它不但能直接影響細菌的生理代謝，而且酸化產(chǎn)生的質(zhì)子跨膜梯度會影響細菌所必需的營養(yǎng)物質(zhì)進入吞噬體腔內(nèi)。此外，酸性環(huán)境還為吞噬體內(nèi)許多水解酶提供了適宜的pH值，發(fā)揮最佳活性，且有利于活性氧、活性氮的產(chǎn)生，這些都與酸化起協(xié)同抗菌作用[1]。由此可見，吞噬體酸化在宿主防御中起重要作用。

2 結(jié)核分枝桿菌的耐酸機制

2.1 抑制吞噬體與溶酶體融合和酸化過程

2.1.1表面效應分子早期吞噬體膜上含有Rab5、早期內(nèi)吞體抗原1(early endosome antigen 1，EEA1)和磷脂酰肌醇-3-磷酸(phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P)等標記。在成熟過程中，這些標記逐漸丟失，轉(zhuǎn)而獲得Rab7和溶酶體相關(guān)膜蛋白(lysosome-associated membrane protein，LAMP)等晚期吞噬體和溶酶體標記。含有結(jié)核分枝桿菌的吞噬體仍持續(xù)含有Rab5，但缺乏Rab7，提示吞噬體成熟受阻[5]。研究證實，Rab5的效應分子EEA1和人空泡分選蛋白34(human vacuolar protein sorting 34，hVPS34)募集受抑制，導致PI3P不能積累[6]。結(jié)核分枝桿菌通過一系列效應分子來影響PI3P信號通路，如利用細胞壁脂阿拉伯甘露糖(lipoarabinomannan，LAM)阻止鈣流，抑制hVPS34活化，通過SapM水解PI3P等[1]，阻止早期吞噬體向晚期吞噬體和吞噬溶酶體轉(zhuǎn)變，從而避免吞噬體酸化和溶酶體水解酶等對細菌的殺傷作用。

2.1.2 V-ATPase V-ATPase能利用ATP將質(zhì)子泵入囊泡使其獲得酸性環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)，含有結(jié)核分枝桿菌的吞噬體V-ATPase減少甚至為零，導致酸化受限[7]。這也從另一角度證明結(jié)核分枝桿菌吞噬體與核內(nèi)體的融合受限，因為通常認為存在于成熟吞噬體上的V-ATPase來自內(nèi)體。最近研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase，PtpA)，能結(jié)合至V-ATPase的H亞基，妨礙V-ATPase轉(zhuǎn)運和吞噬體酸化[8]，且PtpA使VPS33B去磷酸化，阻止其與V-ATPase相互作用，從而影響吞噬體與溶酶體融合[9]，證明PtpA在抑制吞噬體酸化中起直接作用。

2.1.3堿性物質(zhì)尿素酶是某些細菌的毒力因子，它不僅能產(chǎn)氨，堿化微環(huán)境，抑制溶酶體酶活性及吞噬體與溶酶體的融合，還能為細菌生長提供氮源。結(jié)核分枝桿菌能利用尿素酶產(chǎn)生大量氨，但不太可能通過氨直接中和溶酶體內(nèi)的酸性環(huán)境起作用，因為其他一些堿性物質(zhì)能升高溶酶體內(nèi)的pH值并促進吞噬體與溶酶體融合[10]。最近研究表明，在靜息狀態(tài)的巨噬細胞中，尿素酶對含有分枝桿菌的吞噬體有一定的堿化作用；但在激活的巨噬細胞中，堿化作用對酸性更強的吞噬溶酶體內(nèi)環(huán)境沒有影響[11]。至于是否存在其他酶或堿性物質(zhì)在結(jié)核分枝桿菌耐酸中發(fā)揮作用，還有待進一步研究。

2.2 抵抗吞噬體的酸性殺傷作用

2.2.1細胞包膜功能結(jié)核分枝桿菌的細胞壁由肽聚糖層構(gòu)成。共價連接到肽聚糖上的是阿拉伯半乳糖，其胞外末端又與60～90個碳原子長度的分枝菌酸相連。細胞壁外層還存在大量游離脂質(zhì)。一些糖脂橫穿整個質(zhì)膜，錨定在質(zhì)膜上并延伸到細胞壁外。這一復雜的細胞包膜結(jié)構(gòu)有效地阻止了質(zhì)子進入。對一些結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌酸敏感突變株的研究發(fā)現(xiàn)，它們大多存在細胞壁功能相關(guān)基因的缺陷[12, 13]，且許多細胞壁或脂質(zhì)合成基因在低pH值下轉(zhuǎn)錄活性改變[14, 15]。Vandal等通過篩選10 100株結(jié)核分枝桿菌轉(zhuǎn)座子突變株，發(fā)現(xiàn)21個耐酸相關(guān)基因[13]，有15個基因與細胞膜功能相關(guān)。當用檸檬酸磷酸鹽緩沖液重新對21株菌株篩查時，只有2株突變株對酸敏感。很可能是以前培養(yǎng)基中的吐溫80被水解為油酸，對細菌產(chǎn)生殺傷作用。確認后的2個耐酸相關(guān)基因分別是Rv2136c和Rv3671c。前者參與肽聚糖合成，后者是絲氨酸蛋白酶，能修飾細胞壁。這2株轉(zhuǎn)座子突變株在吞噬體內(nèi)不能維持細胞內(nèi)pH值。另外，Rv2136c突變株對細胞壁刺激、氧刺激和宿主環(huán)境等高度敏感[16]。但隨后發(fā)現(xiàn)Rv2136c突變株的酸敏感表型不能被回補，且Rv2136c敲除株并不表現(xiàn)為酸敏感和減毒，表明Rv2136c與上述表型并無直接聯(lián)系，可能由其他未知原因引起[17]。

2.2.2改變代謝途徑在正常情況下，結(jié)核分枝桿菌一般通過三羧酸循環(huán)代謝糖類獲得碳源和能量。當其被巨噬細胞吞噬后，結(jié)核分枝桿菌可通過乙醛酸旁路代謝脂肪酸，同時降低代謝率以維持其在巨噬細胞中的生存。Fisher等通過體外pH 5.5酸性條件模擬吞噬體內(nèi)的酸性環(huán)境，利用DNA微陣列方法分析結(jié)核分枝桿菌的整體基因表達情況[15]。發(fā)現(xiàn)在酸刺激15和30 min后，有81個基因表達顯著改變，其中改變最大的是幾個非核糖體肽合成酶/聚酮合酶(nonribosomal peptide synthetase/ polyketide synthase，NRPS/PKS)。還有很多表達改變的基因參與脂肪酸代謝，如異檸檬酸裂解酶(isocitrate lyase，Icl)基因icl1表達上調(diào)，而參與分枝菌酸生物合成的kas/FASII操縱子表達下調(diào)。其中異檸檬酸裂解酶是乙醛酸通路的一個關(guān)鍵酶，它能通過乙酰輔酶A(coenzyme A，CoA)中間體將脂肪酸代謝為葡萄糖。因此，icl1基因能在酸性條件下被誘導，表明結(jié)核分枝桿菌可能將低pH值作為進入吞噬體的信號，并通過表達脂肪酸代謝相關(guān)基因在酸性條件下長期生存。

2.2.3基因調(diào)控研究發(fā)現(xiàn)，如果干擾吞噬體酸化，被巨噬細胞吞噬的結(jié)核分枝桿菌中約80%原本表達上調(diào)的基因不再上調(diào)[18]?？梢娝嵝原h(huán)境對結(jié)核分枝桿菌來說是一個重要的刺激信號，能引起基因表達改變。結(jié)核分枝桿菌中存在多個雙組分調(diào)控系統(tǒng)，其中PhoP/R調(diào)控一系列基因的表達，參與脂質(zhì)代謝、缺氧應答的調(diào)控等，影響細菌的毒力[19]。有趣的是，一些受PhoP調(diào)控的基因在酸性刺激下表達也普遍上調(diào)，包括脂質(zhì)代謝相關(guān)的lipF、pks2、pks3、pks4，呼吸相關(guān)的nark1、Rv2390ch和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子whiB6等[14]。Abramovitch等通過對結(jié)核分枝桿菌特有的aprABC基因區(qū)域的研究發(fā)現(xiàn)，PhoP/R能感受低pH值信號并誘導aprABC表達來適應酸性環(huán)境[20]。

分枝桿菌有獨特的蛋白分泌系統(tǒng)，其中包括ESX-1，也稱Ⅶ型分泌系統(tǒng)。它負責分泌6 kDa早期分泌抗原靶分子(early secretory antigenic target of 6 kDa，ESAT-6)和培養(yǎng)濾過蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP-10)[21]。這2種蛋白以1∶1形成二聚體，與細菌的毒力、致病性密切相關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子EspR能調(diào)控Rv3616c-Rv3614c表達，后者能增強ESX-1分泌系統(tǒng)的活性[22]。當ESX-1活性高時，EspR也被轉(zhuǎn)運到細胞外，使轉(zhuǎn)錄活性降低，從而降低ESX-1分泌系統(tǒng)活性，形成反饋調(diào)節(jié)。有趣的是，在酸性條件下，ESAT-6與CFP-10解離，且能溶解宿主細胞膜[23]。結(jié)核分枝桿菌能從吞噬體中逃逸至細胞質(zhì)中，提示ESAT-6很有可能在其中發(fā)揮作用。

2.2.4其他Saviola等用體內(nèi)表達啟動子誘捕系統(tǒng)(promoter trap system)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，lipF和Rv0834c基因的啟動子在pH 4.5時表達上調(diào)[24]。隨后Richter驗證lipF啟動子只在酸性條件下表達上調(diào)，在其他如高溫、氧刺激、缺氧等條件下表達沒有改變[25]。LipF編碼一種脂肪酶/酯酶，研究人員猜測該酶可能水解巨噬細胞中的脂肪酸或修飾細菌細胞壁。曾有報道結(jié)核分枝桿菌的lipF轉(zhuǎn)座子突變株在小鼠肺部生長減毒，但還沒有體外實驗證實lipF突變株對酸敏感[24]。Rv0834c編碼只存在于病原性分枝桿菌中的PE-PGRS蛋白，其功能尚不清楚。

結(jié)核分枝桿菌外膜蛋白A(outer membrane protein A ofMycobacteriumtuberculosis，OmpATb)是一種pH依賴的孔形成膜蛋白，只在某些毒力菌株中表達，參與物質(zhì)轉(zhuǎn)運[26]。OmpATb通道在酸性條件下自動關(guān)閉。OmpATb缺失導致某些水溶性小分子物質(zhì)的滲透性降低，結(jié)核分枝桿菌對酸性環(huán)境更敏感，在巨噬細胞和小鼠中生長能力受損[27]。最近研究還發(fā)現(xiàn)，OmpATb并不具備一般孔蛋白的功能，但ompATb所在的操縱子編碼的蛋白與氨快速分泌、中和pH值和分枝桿菌在酸性條件下的生長有關(guān)[28]。

鎂離子運輸?shù)鞍?Mg2+transport protein，MgtC)可能是一種細胞膜上的Mg2+轉(zhuǎn)運體。結(jié)核分枝桿菌mgtC突變株在酸性且低鎂的培養(yǎng)基中生長受抑制，在巨噬細胞和小鼠中毒力減弱[29]，而且在這種酸性條件下對Mg2+的需求不可被其他二價離子(如Ca2+、Mn2+、Zn2+)等替代[30]。在大腸埃希菌中同樣發(fā)現(xiàn)一個可能與耐酸相關(guān)的MgtC家族[31]。但最近研究發(fā)現(xiàn)，MgtC本身并沒有攝取或結(jié)合Mg2+的功能，可能通過蛋白相互作用發(fā)揮調(diào)節(jié)因子的作用[32]。MgtC在分枝桿菌耐酸中的具體功能有待進一步研究。

研究人員還發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌的耐酸具有氧依賴性。在有氧條件下，分枝桿菌能抵抗弱酸(pH 5.5)環(huán)境；在低氧或缺氧條件下，分枝桿菌對酸更敏感。而外源性硝酸鹽能作為電子受體，在酸性、缺氧條件下，通過硝酸呼吸作用保護分枝桿菌[33]。

3 結(jié)語

綜上所述，當結(jié)核分枝桿菌被巨噬細胞吞噬后，能對吞噬體內(nèi)的酸性環(huán)境作出適應性應答，抑制吞噬體的融合與酸化，且有一定的耐受酸性環(huán)境的能力。分枝桿菌的細胞壁及代謝可能在耐酸中發(fā)揮重要作用，其分子機制還有待研究。如上述提到的Rv3671c蛋白，有研究在尋找其特異性底物及水解通路，試圖用選擇性化學抑制劑使其催化部位失活[34]，這樣可能改變結(jié)核分枝桿菌的細胞壁成分，使其對酸刺激更敏感。同時，結(jié)核分枝桿菌在酸刺激下通過調(diào)控子(如PhoP/R)引起一系列基因表達的改變，如果藥物作用于該調(diào)控子，可能造成細菌在宿主體內(nèi)存活能力下降。此外，細菌對不同刺激條件的反應通路可能存在交叉，其他應激通路的研究或許可為尋找相關(guān)的耐酸通路帶來提示。通過作用于應激通路中的關(guān)鍵分子，可能引起細菌對環(huán)境的適應力下降，更易被清除。因此，更深入了解結(jié)核分枝桿菌耐酸機制有助于為藥物開發(fā)提供新的靶點。

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