李慧一，曹風雅，胡瀾也，佘凱芩，崔澤林

上海交通大學醫(yī)學院病原生物學教研室，上海 200025

金黃色葡萄球菌可引起心內膜炎、骨髓炎、肺炎、腦膜炎等[1,2]，是重要的條件致病菌和醫(yī)院內感染細菌[3]。近70年來，由于抗生素的廣泛使用，金黃色葡萄球菌耐藥菌株不斷出現。20世紀40年代第1種抗生素——青霉素問世，金黃色葡萄球菌很快對其產生耐藥；隨后甲氧西林開始應用，但1年后便出現新的耐藥菌株——耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)；80年代萬古霉素在臨床廣泛應用，耐萬古霉素菌株很快出現[4]；之后利奈唑胺和達普霉素作為對抗MRSA的新型藥物，目前已有耐藥菌株報道[5]。這些耐藥菌株不斷增多，且在世界范圍內流行，特別是MRSA。在美國1999～2005年因感染MRSA而入院的患者增加1倍多，其中被診斷為敗血癥的患者增加81.2%[6]。在此形勢下，即使投入大量資金繼續(xù)研究新型抗生素，耐藥問題仍無法得到解決，因此尋找控制耐藥菌的新對策十分迫切。目前有望替代抗生素的控菌手段有抗菌肽、噬菌體等。其中，噬菌體的發(fā)現早于抗生素，后因抗生素的普及而被忽視。在細菌耐藥問題日趨嚴峻的現在，人們再次對噬菌體及其裂解酶的控菌效果予以關注。本文就噬菌體及其裂解酶控制金黃色葡萄球菌的研究進展進行介紹。

1 噬菌體及其衍生物控制細菌感染的概況

D′ Herelle在1917年第1次提出用噬菌體消滅細菌性病原[7]。1919年，法國巴黎的一家醫(yī)院首次對感染志賀菌的痢疾患者注射噬菌體，使年輕患者迅速恢復[8]，但這次治療并未立即報道。噬菌體治療人類疾病的案例首次報道于1921年——Richard Bruynoghe和Joseph Maisin 使用噬菌體治療葡萄球菌引起的皮膚病[9]。20世紀40年代，Eli Lilly公司生產了7種用于人體的噬菌體制劑，其中包括抗葡萄球菌制劑[10]。第二次世界大戰(zhàn)期間，研究人員使用葡萄球菌等細菌噬菌體混合物制劑以控制傷者感染。遺憾的是，早期的噬菌體治療并不規(guī)范，而且對噬菌體的認識不夠全面，加之青霉素這一能顯著控制細菌感染的抗生素問世并大規(guī)模工業(yè)化生產和廣泛應用，使許多西方國家放棄了噬菌體療法[8]。從20世紀40年代的耐青霉素金黃色葡萄菌到60年代的MRSA，耐藥金黃色葡萄球菌的流行越來越引起人們的關注[11]，開發(fā)新型抗生素尤為迫切。但由于抗生素的篩選作用，細菌終將進化對其耐藥，將噬菌體作為一種控制細菌的手段，重新引起研究者的重視。

盡管西方國家曾一度放棄噬菌體療法，但一些學者仍一直從事噬菌體的研究。迄今為止，噬菌體作為細菌感染的非傳統療法近1個世紀，作為基因研究工具達半個世紀，作為探究特異性靶向結合蛋白的工具約20年，作為疫苗工具或基因傳遞媒介近10年[12]。噬菌體作為細菌感染的療法在波蘭、蘇聯等國家取得成功[13]。20世紀80年代，應用金黃色葡萄球菌噬菌體治療肺和胸膜化膿性患者顯示出有效性且無不良反應[9]。近來，美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，FDA)允許在食品加工過程中使用噬菌體以控制細菌數目[13]。已有實驗證實，將噬菌體應用于奶酪、牛奶、海鮮等即食產品的加工過程，對控制引發(fā)食源性疾病的病原體是有效的[14]。在動物實驗中，噬菌體也表現出其有效控制耐藥金黃色葡萄球菌的能力。2005年，Wills等應用利奈唑胺和裂性噬菌體聯合治療小鼠糖尿病足，使MRSA感染得到有效控制[15]。一些用于臨床的噬菌體也表現出強大的殺菌能力，能有效控制燒傷患者的感染[7]。目前關于噬菌體裂解酶的研究結果表明，其具有控制細菌的能力[2]。

2 噬菌體及其裂解酶控制金黃色葡萄球菌的體內外實驗

在進入臨床試驗階段前，噬菌體控制細菌感染的有效性及是否有不良反應需通過動物實驗進行評估。1992年，Soothill嘗試用小鼠模型驗證金黃色葡萄球菌噬菌體Φ 131的保護作用，但不幸的是，實驗未取得成功。因此，在動物實驗水平上噬菌體能治療金黃色葡萄球菌感染的說法一直未被證實[3]。近年來，研究人員對噬菌體愈發(fā)關注，希望能找到理想噬菌體來控制耐藥菌感染，同時通過許多動物實驗來證明其有效性(表1)。2003～2011年，日本、意大利、印度和中國臺灣地區(qū)的研究者們通過建立小鼠腹腔感染模型或靜脈內注射感染模型，對噬菌體Φ MR11、Msa、Φ MR25、P-27/HP、Stau2和P954能否控制金黃色葡萄球菌感染進行研究。結果顯示，在建立的動物模型中，噬菌體能控制金黃色葡萄球菌引起的致死性感染，且未觀察到不良反應。另外，英國的研究人員通過建立家兔傷口感染致膿腫模型，證明噬菌體LS2a能有效預防金黃色葡萄球菌導致的膿腫形成。加拿大的研究人員證明，在泌乳奶牛的亞臨床乳腺炎模型中，噬菌體K能治愈患病的泌乳奶牛。這些研究結果使人們對應用噬菌體控制金黃色葡萄球菌感染抱有極大希望。

隨著耐藥菌的增多，噬菌體的優(yōu)勢被更多學者認可。但多年來金黃色葡萄球菌噬菌體生物學特性及動物實驗的相關研究表明，噬菌體的制備、保存、作用條件等方面存在較多局限性。與抗生素類似，細菌也可能會對噬菌體產生抗性，然而大自然中噬菌體的多樣性和變異性也為噬菌體控制細菌提供了不竭的資源庫。此外，具有對細菌外圍基本組成骨架有破壞作用的噬菌體裂解酶可彌補細菌產生噬菌體抗性的不足。因此，噬菌體裂解酶作為抗菌藥物的候選者越來越引起關注(表2)。美國研究者通過基因工程獲取3種不同的ClyS，證明其在各種小鼠模型中控制金黃色葡萄球菌感染的有效性。此外，韓國、愛爾蘭和德國的研究者對噬菌體裂解酶在體外抗金黃色葡萄球菌的作用進行實驗，結果顯示噬菌體裂解酶具有良好的抗金黃色葡萄球菌作用。

表1噬菌體在動物實驗水平控制金黃色葡萄球菌的研究進展

Tab.1 Research progress on bacteriophage control ofStaphylococcusaureusinvivo

時間(年份)地點 噬菌體噬菌體類型噬菌體來源動物模型結論是否觀察到不良反應2003日本Φ MR11[3]長尾噬菌體科162名健康者和高知醫(yī)科大學附屬醫(yī)院患者的鼻腔分泌物小鼠腹腔感染模型控制金黃色葡萄球菌引起的致死性感染,小鼠存活。Φ MR11迅速出現在血液循環(huán)中且一直保持高水平,直至細菌根除否2005英國LS2a[16]———污水家兔傷口感染致膿腫模型在感染金黃色葡萄球菌的家兔模型中,能有效預防膿腫形成。膿腫面積和細菌數目隨噬菌體劑量減少而逐漸增加否2006加拿大K[17]肌尾噬菌體科泌乳奶牛的乳汁泌乳奶牛的亞臨床乳腺炎模型24只因感染金黃色葡萄球菌而患亞臨床乳腺炎的泌乳奶牛治愈否2007意大利Msa[18]———那不勒斯費德里克二世大學醫(yī)學院住院患者小鼠靜脈內注射感染模型使97%接種致死量金黃色葡萄球菌A170的小鼠免于死亡;接種非致死量的小鼠于感染10 d后再接種噬菌體,細菌也能完全清除。噬菌體Msa能有效預防膿腫形成,減少膿腫重量和細菌荷載量否2010日本Ф MR25[19]長尾噬菌體科日本高知醫(yī)科大學附屬醫(yī)院患者的鼻腔分泌物小鼠腹腔感染模型給已接種致死劑量金黃色葡萄球菌SA37的小鼠腹腔內注射Ф MR25能使其免于死亡。Ф MR25的治療效果取決于噬菌體劑量否2010印度P-27/HP[20]———印度的污水小鼠感染模型小鼠免于患菌血癥及繼發(fā)死亡。在為期3 d的治療中,金黃色葡萄球菌P-27/HP CFU在脾中的數目明顯減少6 log(99.9%)否2010中國臺灣地區(qū)Stau2[21]肌尾噬菌體科中國臺灣地區(qū)衛(wèi)生署南投醫(yī)院收集的氣管導管吸出物小鼠腹腔感染模型使感染金黃色葡萄球菌的小鼠100%免于致死性感染。其抗菌譜比多價噬菌體K寬(47%)否2011印度P954[13]短尾噬菌體科印度恒河小鼠腹腔感染模型使感染金黃色葡萄球菌LD80的小鼠免于死亡。患有中性粒細胞減少癥的小鼠單獨接種噬菌體P954無中毒或死亡現象,證明了噬菌體P954的安全性否

表2金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶在體內外控制金黃色葡萄球菌的研究進展

Tab.2 Research progress on lysin control ofStaphylococcusaureusinvivoandinvitro

年份地點酶名稱獲取途徑動物模型/體外結論2009韓國SAL-2[22]由噬菌體SAP-2的基因編碼所得,將該基因導入大腸埃希菌中表達出SAL-2體外SAL-2對金黃色葡萄球菌(包括MR-SA)有特異溶解活性。SAL-2的最低有效抑制濃度約為1 μ g/ml。與噬菌體SAP-2相比,SAL-2在去除金黃色葡萄球菌生物膜時有更寬的抗菌譜2010美國ClyS[2]由金黃色葡萄球菌Twort噬菌體裂解酶的N端催化結構域和另一金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶Φ NM3的細胞壁靶區(qū)結構域構成小鼠鼻腔非定植模型單獨接種ClyS 1 h后可見鼻腔黏膜中MRSA活性去除率呈2 log下降小鼠敗血癥模型 被MRSA感染,本該因細菌性膿毒癥于24 h內死亡的小鼠接受腹膜內注射ClyS后存活小鼠腹腔感染模型一定劑量的ClyS或苯唑西林單獨使用,小鼠的存活率低且與對照組無顯著差異;若ClyS與苯唑西林聯合使用,則能通過協同作用使小鼠免于MRSA導致的敗血癥死亡2011愛爾蘭CHAPk[23]由含3個結構域的抗葡萄球菌噬菌體裂解酶LysK 衍生出來的單一結構域體外CHAPk的抗菌譜包括所有葡萄球菌種。在pH 9、15 ℃時,該酶活性最高。CHAPk比溶葡萄球菌酶作用更快2011德國PRF-119[24]由噬菌體K細胞內溶素(LysK)的CHAP結構域和溶葡萄球菌素的細胞壁結合結構域(CBD)構成體外PRF-119對該實驗中所有被測試的金黃色葡萄球菌菌株(包括MRSA分離株)都具有較高的抗菌活性2012美國ClyS[25]鏈球菌λ SA2細胞內溶素的肽鏈內切酶域分別融合來自溶葡萄球菌酶的細胞壁結合結構域和來自葡萄球菌噬菌體K細胞內溶素的細胞壁結合結構域小鼠乳腺炎模型 2種融合蛋白均能殺死從牛乳腺炎分離出的16種金黃色葡萄球菌(包括MRSA)2012美國ClyS[26]由金黃色葡萄球菌Twort噬菌體裂解酶的N端催化結構域和另一金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶Φ NM3的細胞壁靶區(qū)結構域構成小鼠皮膚感染模型與莫匹羅星相比,在感染小鼠模型中ClyS能根除更多的甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)和MRSA,且不易出現耐藥性

3 與金黃色葡萄球菌噬菌體有關的臨床試驗

金黃色葡萄球菌噬菌體及其裂解酶的療效已被多種動物實驗證實，且大部分實驗未觀察到不良反應。在投入臨床治療前，需有相關的臨床試驗對其進行評估。但在歐洲和美國FDA的管轄范圍內，目前僅有少數臨床試驗按照現代標準開展[29]。噬菌體難以用于臨床試驗，可能有以下原因。①抗生素的普及：抗生素抗菌譜廣，生產技術成熟且療效好；②安全性：噬菌體裂解細菌能引起機體產生免疫反應，某些噬菌體攜帶毒素基因，與細菌整合后引起毒素反應；③不易控制：噬菌體在細菌體內可無限增殖，用于臨床時難以控制劑量；④專一性強：需明確致病菌才可對癥使用噬菌體，相對延緩了治療時間。

鑒于以上原因，目前噬菌體相關臨床試驗還處于起步階段，研究較少。在處理燒傷傷口時，細菌感染帶來一個棘手的問題——極難治愈的熱損傷。金黃色葡萄球菌是早期燒傷傷口感染的常見病原體，銅綠假單胞菌則是燒傷醫(yī)療中心最常見且致命的病原體。2009年，Merabishvili等用BFC-1處理感染的燒傷傷口。BFC-1是一種高度純化和嚴格配制的噬菌體“雞尾酒”，包含銅綠假單胞菌噬菌體14/1、PNM 和金黃色葡萄球菌噬菌體ISP(內毒素已清除)。這些噬菌體來源于阿斯特麗德女王軍隊燒傷中心(Burn Wound Centre, Queen Astrid Military Hospital)分離到的銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。其制備過程簡要闡述如下：首先，收集銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌產生的毒性噬菌體，然后用明確的細菌菌株進行初次篩選，篩選出8種噬菌體；接著用燒傷中心實際分離出的細菌菌株進行二次篩選，最后篩選出3種合適的噬菌體：PMN、14/1和ISP，將其以1011pfu/ml的濃度于4 ℃儲存。去除內毒素，獲得成品BFC-1。經患者許可，用配有20G×20號針頭的注射器吸取3 ml BFC-1，然后用無菌的噴嘴替代注射器針頭，將BFC-1噴灑在感染的燒傷傷口。BFC-1已被布魯塞爾自由大學教學醫(yī)院的倫理會批準，并于2007年10月開始進行臨床試驗評估。截止該文發(fā)表時，BFC-1已被外敷于8例患者感染的燒傷傷口，沒有觀察到任何不良反應[7]。

2002年Weber-Dabrowska等還報道，化膿性細菌(包括金黃色葡萄球菌)感染患者口服噬菌體溶解產物，發(fā)現其對中性粒細胞的更新和功能有影響。試驗中42例患者患有鼻炎、癤病、鼻竇炎、創(chuàng)傷后感染、生殖道感染、慢性支氣管炎、尿道感染、肛周膿腫、皮膚感染、雙側中耳炎。對照組為8名健康志愿者。噬菌體制劑能殺死從患者中分離的金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、產酸克雷白菌、摩氏摩根菌、模擬葡萄球菌、溶血性葡萄球菌和腐生葡萄球菌?；颊叱掷m(xù)3周口服噬菌體制劑，每日3次，每次5 ml。分別觀察治療前、治療3周后、治療3個月后的血涂片，比較患者與健康志愿者的中性粒細胞及其前體和吞噬指數變化?；颊咧委熐爸行粤＜毎绑w比例高于健康志愿者，治療后繼續(xù)上升；患者治療前中性粒細胞比例低于健康志愿者，治療后進一步下降；患者治療前吞噬指數低于健康志愿者，治療后進一步下降。結果表明，噬菌體治療有效并加速中性粒細胞的更新，同時伴有中性粒細胞吞噬細菌能力降低。雖然在治療中成熟中性粒細胞的減少似乎不太有利，但其與患者的康復密不可分。此研究還發(fā)現，長久刺激中性粒細胞的更新可增強人體免疫的第1道防線[27]。

4 結語

金黃色葡萄球菌能引起致死性感染，其耐藥問題日益嚴重，研究新型抗菌藥物的任務更加緊迫。噬菌體療法作為一種極具潛力的替代療法，重新引起研究者的關注。噬菌體療法除能解決耐藥菌株無藥可治的問題，與傳統的抗生素療法相比，還有許多其他優(yōu)點。首先，與抗生素不同，噬菌體能特異殺傷靶細菌，且不會因破壞機體正常菌群而引起繼發(fā)感染[20]；其次，因噬菌體本身能變異，從而有更加多樣的噬菌體能對耐某些噬菌體細菌的出現作出迅速反應[28]；同時，噬菌體及其產物對真核細胞影響較小，因此不良反應相對較少[19,20]；另外，研究噬菌體療法所用資金與開發(fā)一種有效的新型抗生素相比更經濟。

噬菌體療法在20世紀初被提出，但相關臨床試驗少見。至今研究人員對噬菌體控制感染性疾病的效果仍存有諸多疑問，因此，世界上大多數地區(qū)并不接受噬菌體療法。雖然噬菌體遺傳學和生理學機制已部分闡明，但若作為一種治療方法，尚缺乏大量正規(guī)臨床試驗去證實其安全性和有效性。在噬菌體制劑獲得臨床應用許可之前，需注意以下幾點：噬菌體的鑒定、制劑的效能和生物活性、制作工藝、產品純度、制劑的穩(wěn)定性和儲存條件、無菌控制[29]。

雖然對噬菌體的了解還不透徹，但研究人員通過大量實驗正嘗試解決其應用于臨床時所面臨的諸多問題。2011年Paul等研制出一種重組的、缺乏裂解能力的金黃色葡萄球菌溫和噬菌體P954，能靶向殺滅細菌但不裂解宿主菌，且不影響療效，解決了噬菌體裂解細菌引起的免疫反應[13]。隨著對噬菌體控制細菌研究的不斷進展，期待噬菌體療法將會逐步完善，直至成功用于臨床。

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