朱詩應(yīng)，戚中田

第二軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室，上海市醫(yī)學(xué)生物防護重點實驗室，上海 200433

細菌檢測包括傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)檢查、分離培養(yǎng)、生化鑒定、免疫分析等多種方法，其中細菌的分離培養(yǎng)最為關(guān)鍵，但對苛養(yǎng)菌及生長緩慢的細菌分離培養(yǎng)很棘手。近年來，各種基因診斷技術(shù)在細菌檢測中不斷開發(fā)、利用，尤其是基于聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)的基因診斷技術(shù)發(fā)揮著越來越重要的作用。本文就細菌核糖體小亞基16S RNA的基因(16S rDNA)在細菌鑒定與分類中的應(yīng)用研究進展作一綜述。

1 16S rDNA

16S rDNA是編碼原核生物16S rRNA的基因，長度約1 500 bp，存在于所有細菌、衣原體、支原體、立克次體、螺旋體和放線菌等原核生物的基因組中，由多個保守區(qū)(conserved region)和與之相間的多個可變區(qū)(variable region)組成。保守區(qū)為所有細菌共有，細菌之間無顯著差異[1]；可變區(qū)在不同細菌之間存在一定程度的差異，具有細菌屬或種特異性。PCR擴增16S rDNA包含兩層含義：在保守區(qū)設(shè)計PCR通用引物，理論上可將存在于待測標(biāo)本中的各種細菌都擴增出來；若選擇可變區(qū)設(shè)計PCR特異性引物，則可將標(biāo)本中的細菌鑒定到屬、種乃至菌株水平。因此，16S rDNA已成為細菌鑒別與分類研究中較理想的靶序列[2]。

2 基于16S rDNA可變區(qū)序列的應(yīng)用研究

細菌16S rDNA中含有9個可變區(qū)[3]，命名為V1～V9區(qū)。確定某個可變區(qū)內(nèi)具有細菌種特異性的序列就可能獲得細菌實驗室診斷的有用靶點。除V2、V3、V4區(qū)稍長外，其他各高變區(qū)序列都很短，沒有哪個高變區(qū)能區(qū)分所有細菌[4]。Chakravorty等[5]對110種細菌(分別來自于人體、環(huán)境及美國疾病預(yù)防控制中心鑒定的致病菌)共113份完整的16S rDNA的V1～V8區(qū)序列進行詳細研究，分別構(gòu)建了基于V1～V8區(qū)序列的特異性系統(tǒng)樹(dendrogram)。結(jié)果顯示，V1區(qū)能區(qū)分金黃色葡萄球菌與血漿凝固酶陰性葡萄球菌；V2和V3區(qū)能將除腸桿菌科以外的細菌鑒別至屬的水平，V2區(qū)尤其適合于鑒別分枝桿菌屬內(nèi)的菌種，V3區(qū)能很好區(qū)別嗜血桿菌屬內(nèi)各種細菌；V6區(qū)也能區(qū)分除腸桿菌科以外的大多數(shù)菌種，特別是通過單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析可將炭疽芽胞桿菌從與其生物學(xué)性狀非常相似的蠟樣芽胞桿菌群細菌中區(qū)分開來；而通過V4、V5、V7和V8區(qū)序列來鑒別細菌至屬或菌種的可能性不大。Jacob等[6]收集了31株弗朗西斯菌屬的細菌及96份臨床分離株，通過對16S rDNA V1區(qū)37個核苷酸片段的PCR擴增和測序，不僅能將臨床或環(huán)境標(biāo)本中的弗朗西斯菌屬成功鑒定出來，結(jié)合SNP分析(根據(jù)第12位核苷酸T/G不同)還可將弗朗西斯菌屬的細菌分成2個組，引起人類和動物土拉熱病的土拉熱弗朗西斯菌(Francisellatularensis)的3個亞種均在第1組，其他幾個菌種則全在第2組。因此，該方法可快速甄別具有強傳染性的土拉熱弗朗西斯菌。

3 基于16S rDNA全長或部分序列的應(yīng)用研究

3.1 用于鑒定難以培養(yǎng)的細菌

20世紀(jì)90年代初，Relman等[7]針對桿菌性血管瘤(bacillary angiomatosis)的細菌培養(yǎng)與鑒定一直未獲成功的難題，采用PCR方法從患者組織標(biāo)本中擴增細菌16S rDNA片段，并通過測序和比對分析，首次成功鑒定出該血管瘤的病原菌為伏爾希尼立克次體(Rochalimaeaquintana)。1992年又用同樣方法鑒定出惠普爾病(Whipple’s disease)的病原菌為一種放線菌，并根據(jù)種系進化圖譜研究將其系統(tǒng)命名為Tropherymawhippelii[8]。何亮等用PCR從恒河猴陰道分泌物的厭氧菌培養(yǎng)物中擴增出特異片段，經(jīng)序列分析成功檢測出與細菌性陰道病密切相關(guān)而用一般方法難以純培養(yǎng)的動彎桿菌[9]。在心內(nèi)膜炎的細菌學(xué)診斷中，傳統(tǒng)的血培養(yǎng)或心瓣膜細菌培養(yǎng)陽性率很低。Marín等[10]對177份心瓣膜標(biāo)本進行細菌16S rDNA通用引物定量PCR擴增與測序，結(jié)果表明定量PCR檢測的敏感度、特異度、陰性預(yù)期值和陽性預(yù)期值分別達到96%、95.3%、98.4%和88.5%，該法可為心內(nèi)膜炎的及時處理和抗生素的合理選擇提供參考依據(jù)。

3.2 用于區(qū)分進化關(guān)系密切的細菌

炭疽芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌三者基因序列的同源性>99%，相互之間鑒別較難，被稱為蠟樣芽胞桿菌群(Bacilluscereusgroup)，甚至有學(xué)者認(rèn)為三者屬于同一個種[11]。Sacchi等[12]對不同地區(qū)的107株細菌(包括86株炭疽芽胞桿菌、10株蠟樣芽胞桿菌和11株蘇云金芽胞桿菌)進行全長16S rDNA的擴增和測序，發(fā)現(xiàn)在全長1 554 bp序列中存在8處SNP差異，據(jù)此可分為不同16S基因型，86株炭疽芽胞桿菌均屬其中的第6型。在198份待測臨床標(biāo)本中檢測出該基因6型陽性標(biāo)本7份，而這7份標(biāo)本均來自于臨床確診的炭疽患者。結(jié)果顯示，16S rDNA測序方法不僅可將這3種關(guān)系相近的芽胞桿菌準(zhǔn)確區(qū)別開來，還能直接對臨床標(biāo)本進行檢測，適合于生物恐怖事件中對炭疽芽胞桿菌的快速鑒定。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex)內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌等細菌雖然存在明顯的表型(phenotype)差異和致病性差異，但通過對結(jié)核分枝桿菌ATCC 27294株、牛分枝桿菌ATCC 19210株、非洲分枝桿菌ATCC 25420株的16S rDNA擴增和測序，發(fā)現(xiàn)三者16S rDNA沒有任何堿基差異，基因型(genotype)完全相同，據(jù)此將它們確定為一個種內(nèi)的不同亞種(subspecies)[13]。

3.3 用于鑒定血液培養(yǎng)的細菌

王永智等[14]在對20余種致病菌進行16S rDNA多序列比對的基礎(chǔ)上，設(shè)計擴增細菌16S rDNA的熒光定量PCR通用引物，檢測血液細菌污染模擬標(biāo)本，靈敏度可達105CFU/ml。應(yīng)燕玲等[15]通過13種標(biāo)準(zhǔn)菌株建立了一種基于16S rDNA全長特異性擴增和測序的方法，利用與GenBank數(shù)據(jù)庫比對，成功鑒定出血制品污染的11種未知細菌。Horvat等[16]報道1例患者第2次住院時RapID全自動細菌鑒定儀鑒定其血培養(yǎng)均為蒼白桿菌，但改用Vitek全自動細菌鑒定儀檢測，結(jié)果顯示其為羊布魯菌。作者擴增該菌的全長16S rDNA并進行測序，發(fā)現(xiàn)其序列與SmartGene數(shù)據(jù)庫中25個布魯菌序列100%同源，后經(jīng)美國疾病預(yù)防控制中心確定其血清型為豬布魯菌。Dash等[17]對1例患者的分離菌株進行16S rDNA測序，糾正了原來用MicroScan Walk-Away細菌鑒定儀作出的錯誤結(jié)果，最終確定其為羊布魯菌。這些研究提示，目前使用的全自動細菌鑒定儀在鑒定布魯菌時可能出現(xiàn)差錯，最終確認(rèn)有必要對分離株進行16S rDNA測序。

美國Maastricht大學(xué)醫(yī)學(xué)中心研究的實時定量16S rDNA PCR擴增系統(tǒng)，利用通用探針外加種或?qū)偬禺愋蕴结樀亩嗵结樂?multiprobe assay)，能在2 h內(nèi)對血液感染中常見的幾種細菌包括革蘭陰性的假單胞菌、大腸埃希菌及革蘭陽性的葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌等進行快速鑒定[18]。該作者還建立了測定細菌對抗生素敏感度的半定量方法，將血培養(yǎng)陽性標(biāo)本分別加入不同的抗生素37 ℃培養(yǎng)6 h后，再用定量PCR檢測細菌16S rDNA，其對應(yīng)的循環(huán)閾值(cycle threshold, Ct)大小反映細菌生長抑制程度，據(jù)此判斷細菌對某種抗生素是敏感或耐藥。該法對血液感染細菌的鑒定及藥敏試驗?zāi)茉? d內(nèi)完成，與常規(guī)培養(yǎng)及藥敏方法至少需2～3 d相比，在病原診斷和抗生素選擇方面具有快速優(yōu)勢，有助于菌血癥或敗血癥患者的及時救治[19]。

3.4 用于發(fā)現(xiàn)細菌新種類

臨床實驗室碰到一些新的細菌，因不能明確種類，常難以評估其潛在的致病性。一般而言，2株菌若16S rDNA全長的同源性≥99%，為同種細菌；若在97%～98.9%，一般為同屬不同種；若<95%，則為不同屬。Woo等[20]報道，2001～2007年全球通過16S rDNA測序已發(fā)現(xiàn)細菌新種多達215個，分別屬于29個菌屬，其中15個為新的菌屬，在這15個新屬中就包括了100個新種，如Streptococcussinensis、Laribacterhongkongensis、Clostridiumhathewayi、Borreliaspielmaniih等。在這215個新種中，分枝桿菌屬最多，達12種，諾卡菌屬第2，有6種。從來源看，口腔及牙齒相關(guān)標(biāo)本、胃腸道標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)的新種較多。Schlaberg等[21]對自2006～2010年臨床分離的26 000多株細菌的16S rDNA序列進行分析，發(fā)現(xiàn)與現(xiàn)有公開數(shù)據(jù)庫序列同源性<99%的有673株，表明存在新的種，其中同源性<95%的有111株，表明存在新的屬。在患者標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)95個新分類單位(novel taxa)，共計348株分離株。其中最多的是諾卡菌屬，共有42株分離株，14個新種；其次是放線菌屬，有52株分離株，12個新種。分離株16S rDNA測序分析有助于研究這些新菌種與臨床疾病的關(guān)聯(lián)性。

最新版的《伯杰氏細菌系統(tǒng)分類學(xué)手冊》就參考16S rDNA序列，不再是依據(jù)表型，而是以系統(tǒng)進化框架為基礎(chǔ)進行細菌分類和命名。由美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)于2007年領(lǐng)銜啟動的人體微生物組項目(Human Microbiome Project，HMP)研究中，16S rDNA測序是常用手段之一，通過對志愿者口腔、鼻腔、消化道、皮膚和泌尿生殖道等不同部位的微生物群落進行分析，課題組已公布了從242名成年志愿者中獲得的5 177份16S rDNA序列[22]。16S rDNA測序作為細菌分類的一種系統(tǒng)方法，在HMP計劃中發(fā)揮著重要作用。

3.5 The MicroSeq 500 16S rDNA細菌鑒定系統(tǒng)

美國Applied Biosystems公司開發(fā)的The MicroSeq 500 16S rDNA細菌鑒定系統(tǒng)，基于擴增細菌16S rDNA 5′端的527 bp片段，其引物設(shè)計針對所有細菌，是一種通用的細菌鑒定系統(tǒng)。標(biāo)本中細菌16S rDNA經(jīng)擴增、測序后，與該系統(tǒng)自帶的數(shù)據(jù)庫比對，可實現(xiàn)對分枝桿菌屬、棒狀桿菌屬及諾卡菌屬等細菌的快速鑒定[13,23]。Cloud等[24]通過對119株分枝桿菌的研究發(fā)現(xiàn)，該法與傳統(tǒng)的表型鑒定結(jié)果符合率達87%，適合于鑒定生長非常緩慢的分枝桿菌。有研究表明，該系統(tǒng)對臨床分離株鑒定至屬和種的準(zhǔn)確率可達86.5%和81.1%，對生化檢測無法確定的細菌其鑒定能力甚至強于實驗室常用的3種全自動細菌鑒定儀[23]——Vitek、RapID和API。但該系統(tǒng)對厭氧革蘭陽性桿菌鑒定至屬和種的準(zhǔn)確率稍低，分別為80%和65%，表明其厭氧菌數(shù)據(jù)庫有待不斷擴充[25]。Fontana等研究發(fā)現(xiàn)，對于用Phoenix或Vitek全自動細菌鑒定儀不能鑒定的一些細菌，該系統(tǒng)也能正確鑒定，顯示其在分離株鑒定中可發(fā)揮重要作用[26]。

4 臨床細菌鑒定中存在的挑戰(zhàn)和困難

4.1 引物設(shè)計及擴增假陽性問題

盡管細菌16S rDNA存在多個保守區(qū)，但沒有針對哪個保守區(qū)序列設(shè)計的PCR引物適合于擴增所有細菌。細菌、衣原體、螺旋體、立克次體等不同種類微生物之間16S rDNA保守區(qū)雖然存在共有序列(consensus sequence)，但各種類間仍存在若干堿基不同。擴增細菌16S rDNA的“通用引物”也是相對的，通常是在共有序列的基礎(chǔ)上設(shè)計一套PCR引物[4]。因此，針對被檢微生物的種類不同或臨床標(biāo)本不同，應(yīng)選擇相對應(yīng)的通用引物，才能達到特異擴增效果。如果引物設(shè)計不當(dāng)，還可出現(xiàn)與人基因組的交叉反應(yīng)，導(dǎo)致PCR結(jié)果錯誤判讀[27]。由于PCR本身的高敏感度，極微量污染也可能出現(xiàn)假陽性。污染可發(fā)生在標(biāo)本采集、核酸提取乃至PCR操作各環(huán)節(jié)，尤其是在標(biāo)本(腦脊液，胸、腹腔積液，心瓣膜或活檢標(biāo)本等)采集環(huán)節(jié)中最易發(fā)生。如采取關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)腔滑液標(biāo)本時，應(yīng)避免皮膚表面細菌污染。在使用通用引物進行16S rDNA擴增時，污染細菌會導(dǎo)致假陽性出現(xiàn)。因此，在PCR擴增及其測序的各環(huán)節(jié)都必須建立并遵循標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程(standard operating procedure，SOP)[2,20]。美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2008年發(fā)布的CLSI指南首次增加了專門針對細菌DNA擴增及測序的操作規(guī)范及判斷標(biāo)準(zhǔn)。

4.2 分離株測序鑒定的篩選問題

細菌16S rDNA測序鑒定需進行DNA擴增、測序和分析，其設(shè)備條件和實驗成本比傳統(tǒng)的表型鑒定更高，且不能對所有細菌都鑒定至種的水平，這是目前一般臨床實驗室尚未普及該項目的原因之一[28]。為評價哪些細菌的確需進行16S rDNA測序鑒定，Mahlen等[29]設(shè)計了一套嚴(yán)謹(jǐn)?shù)暮Y選策略，如形態(tài)學(xué)與生化檢測結(jié)果不一致或十分奇怪的分離株、與疾病的相關(guān)性或解剖位置不相符的分離株、在淺層傷口或呼吸道標(biāo)本存在炎性細胞時分離出的優(yōu)勢菌株、尿道標(biāo)本中分離出的菌量達104～105CFU/ml的菌株、正常時無菌體液中分離出的量很多的菌株等，只對這些分離株進行16S rDNA測序鑒定。就革蘭陰性桿菌和球菌而言，實際需進行16S rDNA測序鑒定的只占其總種類的1.6%。采用一般表型鑒定方法能正確鑒定的絕大多數(shù)分離株不需DNA測序，以符合臨床細菌鑒定的低成本、省時、高效的要求。

4.3 比對數(shù)據(jù)庫

目前用于細菌16S rDNA序列檢索和比對的軟件包及其數(shù)據(jù)庫主要有以下幾個。① RDP-Ⅱ：1991年由美國密西根州立大學(xué)建立，可下載免費使用。其序列來自GenBank公共數(shù)據(jù)庫，序列數(shù)量龐大，其中部分序列無從考證其準(zhǔn)確性，導(dǎo)致部分序列品質(zhì)不高[1]。截止2012年12月，注冊的各類16S rDNA達2 639 157條。② MicroSeq ID：1998年由美國Applied Biosystems公司研發(fā)，作為有償使用軟件，其與The MicroSeq 500 16S rDNA細菌鑒定系統(tǒng)配套，包括16S rDNA 5′端527 bp序列和16S rDNA全長序列2個數(shù)據(jù)庫。其序列源自每種細菌的一個純培養(yǎng)菌株的測序結(jié)果，可靠性高是其最大優(yōu)勢。最新的527 bp數(shù)據(jù)庫包含2 020個序列，16S rDNA全長數(shù)據(jù)庫有1 262個序列。③ RIDOM：1999年由德國Ridom GmbH公司開發(fā)，包括奈瑟菌科(Neisseriaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)及分枝桿菌屬等細菌的16S rDNA序列。其序列來自每一種細菌的16S rDNA測序結(jié)果，可免費提供240種細菌的16S rDNA比對。④ SmartGene IDNS：2006年由瑞士SmartGene GmbH公司研發(fā)，有償使用。其序列來源于GenBank，也存在部分序列可靠性不高的問題。因此，標(biāo)本中細菌16S rDNA擴增、測序后，要選擇合適的數(shù)據(jù)庫來進行比對分析[30]。

5 結(jié)語

從鑒定的準(zhǔn)確率來看，建立在細菌分離株基礎(chǔ)上的16S rDNA擴增及測序具有的優(yōu)勢毋庸置疑，因此被視為細菌鑒定與分類的“金標(biāo)準(zhǔn)”。如前文所述，國內(nèi)外實驗室對一些血培養(yǎng)標(biāo)本、抗生素治療后標(biāo)本的研究已證實這一點。但真正應(yīng)用于臨床實驗室標(biāo)本的直接檢測還存在諸多問題，如標(biāo)本污染如何克服、通用引物如何選擇、測序結(jié)果如何準(zhǔn)確判讀等。目前臨床標(biāo)本的細菌鑒定還主要依靠形態(tài)學(xué)、分離培養(yǎng)和生化檢測等常規(guī)方法及Vitek、RapID和API等全自動細菌鑒定系統(tǒng)，而細菌16S rDNA擴增及測序鑒定方法作為一種輔助手段，適合在一些常規(guī)方法難以鑒定的細菌、罕見的細菌、難以培養(yǎng)的細菌、全自動細菌鑒定儀數(shù)據(jù)庫中沒有描述的細菌及新的細菌種類分析等情況下使用。

[1] Petti CA. Detection and identification of microorganisms by gene amplification and sequencing [J]. Clin Infect Dis, 2007, 44(8):1108-1114.

[2] Sontakke S, Cadenas MB, Maggi RG, Diniz PP, Breitschwerdt EB. Use of broad range 16S rDNA PCR in clinical microbiology [J]. J Microbiol Methods, 2009, 76(3):217-225.

[3] Jumpstart Consortium Human Microbiome Project Data Generation Working Group. Evaluation of 16S rDNA-based community profiling for human microbiome research [J]. PLoS One, 2012, 7(6): e39315.

[4] Baker GC, Smith JJ, Cowan DA. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers [J]. J Microbiol Methods, 2003, 55(3):541-555.

[5] Chakravorty S, Helb D, Burday M, Connell N, Alland D. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria [J]. J Microbiol Methods, 2007, 69(2):330-339.

[6] Jacob D, Wahab T, Edvinsson B, Peterzon A, Boskani T, Farhadi L, Barduhn A, Grunow R, Sandstrom G. Identification and subtyping of Francisella by pyrosequencing and signature matching of 16S rDNA fragments [J]. Lett Appl Microbiol, 2011, 53(6):592-595.

[7] Relman DA, Loutit JS, Schmidt TM, Falkow S, Tompkins LS. The agent of bacillary angiomatosis. An approach to the identification of uncultured pathogens [J]. N Engl J Med, 1990, 323(23):1573-1580.

[8] Relman DA, Schmidt TM, MacDermott RP, Falkow S. Identification of the uncultured bacillus of Whipple’s disease [J]. N Engl J Med, 1992, 327(5):293-301.

[9] 何亮，陳群，曾鐘銘，劉志恒，黃英. 通過特異PCR擴增和16S rDNA序列分析檢測動彎桿菌 [J]. 微生物學(xué)報, 2005, 45(1):27-30.

[10] Marín M, Muoz P, Sánchez M, del Rosal M, Alcalá L, Rodríguez-Créixems M, Bouza E,Group for the Management of Infective Endocarditis of the Gregorio Maraón Hospital.Molecular diagnosis of infective endocarditis by real-time broad-range polymerase chain reaction (PCR) and sequencing directly from heart valve tissue [J]. Medicine, 2007, 86(4):195-202.

[11] Helgason E, Okstad OA, Caugant DA, Johansen HA, Fouet A, Mock M, Hegna I,Kolst? AB. Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and Bacillus thuringiensis—one species on the basis of genetic evidence [J]. Appl Environ Microbiol, 2000, 66(6):2627-2630.

[12] Sacchi CT，Whitney AM，Mayer LW，Morey R, Steigerwalt A, Boras A, Weyant RS, Popovic T.Sequencing of 16S rRNA gene：a rapid tool for identification of Bacillus anthracis [J].Emerg Infect Dis, 2002, 8(10):1117-1123.

[13] Hall L, Doerr KA, Wohlfiel LS, Hall L, Doerr KA, Wohlfiel SL, Roberts GD. Evaluation of the MicroSeq system for identification of mycobacteria by 16S ribosomal DNA sequencing and its integration into a routine clinical mycobacteriology laboratory [J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(4):1447-1453.

[14] 王永智，薛利軍，任浩，趙平，朱詩應(yīng)，李冕，戚中田. 基于16S rDNAs的快速檢測血液細菌污染的熒光定量PCR研究[J].中華實驗和臨床感染病雜志(電子版)，2007，1(4):204-210.

[15] 應(yīng)燕玲,許先國,朱發(fā)明, 呂杭軍，嚴(yán)力行. 16S rDNA快速鑒定血液制品中污染細菌的測序方法的建立[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2009，29(10):880-883.

[16] Horvat RT，El Atrouni W, Hammoud K, Hawkinson D, Cowden S. Ribosomal RNA sequence analysis of Brucella infection misidentified as Ochrobactrum anthropi infection [J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(3):1165-1168.

[17] Dash N, Paniqrahi D, Al-Zarouni M，Mishra S. 16S rRNA gene sequence analysis of a Brucella melitensis infection misidentified as Bergeyella zoohelcum [J]. J Infect Dev Ctries, 2012, 6(3):283-286.

[18] Hansen WL, Beuving J, Bruggeman CA, Wolffs PF. Molecular probes for the diagnosis of clinically relevant bacterial infections in blood cultures [J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(12):4432-4438.

[19] Hansen WL, Beuving J, Verbon A, Wolffs PF. One-day workflow scheme for bacterial pathogen detection and antimicrobial resistance testing from blood cultures [J/OL]. J Vis Exp, 2012, (65). pii:3254. http://www.jove.com/video / 3254 / one-day-workflow-scheme-for-bacteial-pathogen-detection.

[20] Woo PC, Lau SK, Teng JL, Tse H, Yuen KY. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories [J]. Clin Microbiol Infect, 2008, 14(10):908-934.

[21] Schlaberg R, Simmon KE, Fisher MA. A systematic approach for discovering novel, clinically relevant bacteria [J]. Emerg Infect Dis, 2012, 18(3):422-430.

[22] Human Microbiome Project Consortium. A framework for human microbiome research [J]. Nature, 2012, 486(7402):215-221.

[23] Woo PC, Ng KH, Lau SK, Yip KT, Fung AM, Leung KW, Tam DM, Que TL, Yuen KY. Usefulness of the MicroSeq 500 16S ribosomal DNA-based bacterial identification system for identification of clinically significant bacterial isolates with ambiguous biochemical profiles [J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(5):1996-2001.

[24] Cloud JL, Neal H, Rosenberry R, Turenne CY, Jama M, Hillyard DR, Carroll KC. Identification of Mycobacterium spp. by using a commercial 16S ribosomal DNA sequencing kit and additional sequencing libraries [J]. J Clin Microbiol, 2002, 40(2):400-406.

[25] Lau SK, Ng KH, Woo PC, Yip KT, Fung AM, Woo GK, Chan KM, Que TL, Yuen KY. Usefulness of the MicroSeq 500 16S rDNA bacterial identification system for identification of anaerobic Gram positive bacilli isolated from blood cultures [J]. J Clin Pathol, 2006, 59(2):219-222.

[26] Fontana C, Favaro M, Pelliccioni M, Pistoia ES, Favalli C. Use of the MicroSeq 500 16S rRNA gene-based sequencing for identification of bacterial isolates that commercial automated systems failed to identify correctly [J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(2):615-619.

[27] Kommedal ?, Simmon K, Karaca D, Langeland N, Wiker HG. Dual priming oligonucleotides for broad-range amplification of the bacterial 16S rRNA gene directly from human clinical specimens [J]. J Clin Microbiol, 2012, 50(4):1289-1294.

[28] Clarridge JE 3rd. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases [J]. Clin Microbiol Rev, 2004, 17(4):840-862.

[29] Mahlen SD, Clarridge JE 3rd. Evaluation of a selection strategy before use of 16S rRNA gene sequencing for the identification of clinically significant Gram-negative rods and coccobacilli [J]. Am J Clin Pathol, 2011, 136(3):381-388.

[30] Conville PS, Murray PR, Zelazny AM. Evaluation of the integrated database network system (IDNS) SmartGene software for analysis of 16S rRNA gene sequences for identification of Nocardia species [J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(8): 2995-2998.