孫青菊，梁冰

解放軍401醫(yī)院檢驗(yàn)科，青島 266071

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa, PA)是假單胞菌屬中最重要的人類致病菌。該菌偏愛潮濕環(huán)境，可發(fā)現(xiàn)于各種水性溶液中，包括消毒劑、肥皂水、眼藥水、軟膏、灌洗液、透析液及治療設(shè)備，成為醫(yī)院中的污染菌。非免疫損害個(gè)體的社區(qū)獲得性PA感染常與水或溶液污染有關(guān)，多表現(xiàn)為淺表感染，如毛囊炎。PA作為醫(yī)院獲得性感染的重要病原體，是醫(yī)院內(nèi)呼吸道感染的首要致病菌。重癥監(jiān)護(hù)室(intensive care unit，ICU)氣管插管患者中PA感染尤為嚴(yán)重， 病死率達(dá)40%～50%。PA還可導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)泌尿道感染、菌血癥等。由于其對(duì)抗菌藥物的耐藥性不斷增加，臨床治療十分棘手。

β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物是含有β-內(nèi)酰胺環(huán)的一大類抗生素，以青霉素類、頭孢菌素類為典型代表，還包括碳青霉烯類、氧頭孢烯類、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類等，其中青霉素和3代頭孢菌素及碳青霉烯類、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素曾是臨床治療PA感染的有效藥物，但隨著超廣譜抗生素的廣泛和不合理使用，PA對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥性逐漸增強(qiáng)。因此，揭示PA對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥機(jī)制對(duì)臨床PA感染的治療有一定指導(dǎo)作用。本文綜述了近年來國內(nèi)外有關(guān)PA對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥及傳播機(jī)制的研究進(jìn)展。

1 β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生

分子生物學(xué)研究表明，PA在抗生素廣泛使用的壓力下可激活多種β-內(nèi)酰胺酶基因，如tem、shv、ampc、oxa、per、ges、imp、vim等，表達(dá)產(chǎn)生的各種β-內(nèi)酰胺酶可水解β-內(nèi)酰胺類包括碳青酶烯類抗菌藥物，從而產(chǎn)生耐藥。已有研究表明，產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是PA對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的重要機(jī)制之一[1-3]。Ambler分類法將β-內(nèi)酰胺酶分為A、B、C、D 4類。又根據(jù)酶分子中氨基酸序列差異，將其主要分為2類：以絲氨酸為活性位點(diǎn)的A、C、D類和以金屬鋅離子為活性位點(diǎn)的B類[4]。

A類β-內(nèi)酰胺酶在臨床最常見，以TEM、SHV型為代表，能水解青霉素類、頭孢菌素類及單環(huán)類抗菌藥物[5]。杜兆豐等[6]從深圳地區(qū)分離到的耐藥PA中，TEM型β-內(nèi)酰胺酶編碼基因攜帶率高達(dá)86.1%。

B類β-內(nèi)酰胺酶以金屬酶為代表，又稱金屬β-內(nèi)酰胺酶，最大特點(diǎn)是可水解碳青霉烯類抗菌藥物[7]。1991年，日本學(xué)者在PA中發(fā)現(xiàn)了第1種質(zhì)粒介導(dǎo)的IMP-1型金屬β-內(nèi)酰胺酶，以后世界各地不斷發(fā)現(xiàn)產(chǎn)VIM 和IMP 型金屬β-內(nèi)酰胺酶的耐藥菌株。目前發(fā)現(xiàn)的獲得性金屬酶基因型主要包括VIM、IMP、SIM、GIM和SPM，其中VIM和IMP型最常見。2012年意大利學(xué)者在臨床分離的PA中發(fā)現(xiàn)了一種新的獲得性金屬酶，命名為FIM-1[8]。金屬β-內(nèi)酰胺酶由質(zhì)?；蛘献?主要是Ⅰ類整合子)等可移動(dòng)遺傳元件介導(dǎo)，傳播能力特別強(qiáng)，可在不同菌種內(nèi)和菌群間進(jìn)行傳播，在亞洲、歐洲、美洲許多國家均有發(fā)現(xiàn)。其對(duì)碳青酶烯類抗菌藥物高效的水解性及缺乏有效的抑制劑，給臨床抗感染治療帶來極大的困擾。Kumar等[9]對(duì)臨床分離的145株耐碳青酶烯類PA和不動(dòng)桿菌的研究顯示，金屬β-內(nèi)酰胺酶陽性菌株達(dá)26.9%，且均表現(xiàn)為多重耐藥。李杰等[10]報(bào)道，在65株耐亞胺培南PA中IMP陽性菌株達(dá)16.9%，產(chǎn)IMP型金屬β-內(nèi)酰胺酶是其耐藥的主要機(jī)制之一。新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶1(New Delhi metallo-beta-lactamase，NDM-1)是一種新命名的金屬β-內(nèi)酰胺酶，2008年首次在1例瑞典患者感染的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)。NDM-1是相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為28 000的單體，能水解幾乎所有的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物[11]。目前發(fā)現(xiàn)攜帶NDM-1的細(xì)菌主要為大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌，還有鮑曼不動(dòng)桿菌、摩氏摩根菌、陰溝腸桿菌、奇異變形桿菌等[12]， PA中未見報(bào)道。

C 類β-內(nèi)酰胺酶以AmpC酶為代表，能水解第1、2、3代頭孢菌素和頭霉素，對(duì)亞胺培南、頭孢吡肟敏感，對(duì)阿米卡星也有一定的敏感性[13]。AmpC 酶分染色體編碼和質(zhì)粒編碼2種。染色體編碼的 AmpC 酶具有可誘導(dǎo)性，一般在革蘭陰性桿菌中低水平表達(dá)，但在β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物誘導(dǎo)劑存在時(shí)，酶產(chǎn)量顯著上升，又稱誘導(dǎo)酶[14]。質(zhì)粒編碼的AmpC酶主要出現(xiàn)在一些缺乏染色體編碼AmpC酶的細(xì)菌中，一般不水解碳青霉烯類抗菌藥物。但在細(xì)菌外膜蛋白缺失、藥物通透性降低時(shí)，可對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥。

D類β-內(nèi)酰胺酶以O(shè)XA為代表，對(duì)苯唑西林和氯唑西林有高度水解活性。OXA酶具有極大的變異性，主要為OXA-10亞型，不同亞型對(duì)青霉素和廣譜頭孢菌素的水解活性有差異[15]。已有研究發(fā)現(xiàn)PA攜帶多藥耐藥性基因的狀況嚴(yán)重。古旭東等[16]報(bào)道，119株P(guān)A中有78株同時(shí)攜帶2個(gè)或2個(gè)以上的耐藥基因，占65.5%。由于攜帶多藥耐藥性基因，PA具有多重耐藥的特性，多重耐藥菌株占臨床分離株的4%～28.8%[17,18]。最近Kumar等[19]從臨床燒傷患者中分離到101株P(guān)A，發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶AmpC和金屬β-內(nèi)酰胺酶的菌株達(dá)45.5%，11.9%的菌株對(duì)3種或3種以上抗菌藥物耐藥。PA中多種β-內(nèi)酰胺酶基因的存在使其對(duì)臨床常用的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥，給臨床治療帶來極大的困難。

2 細(xì)菌外膜通透性的改變

與革蘭陽性菌中β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物不受阻礙即可與青霉素結(jié)合蛋白靶位結(jié)合相比，革蘭陰性菌的外膜是藥物進(jìn)入細(xì)菌的一道屏障。藥物通過膜孔蛋白組成的通道擴(kuò)散。如果細(xì)菌外膜通透性下降，到達(dá)菌內(nèi)的藥物濃度降低，細(xì)菌就會(huì)產(chǎn)生耐藥。PA異常低通透性的外膜結(jié)構(gòu)(小分子藥物穿透其膜孔蛋白的速率只有一般革蘭陰性菌的1%)在耐抗生素中起重要作用[20]。已證明PA外膜非特異性通道蛋白OprF 缺失能引起對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥，而PA 外膜蛋白中OprD2蛋白能形成碳青霉烯類抗生素特異結(jié)合位點(diǎn)，是以亞胺培南為代表的碳青霉烯類抗生素進(jìn)入菌體的特異性通道。OprD2蛋白表達(dá)減弱或缺失是PA對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機(jī)制之一[21]。有研究對(duì)耐亞胺培南PA的oprD2基因采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)77%的耐藥菌株oprD2基因缺失[22]。OprD表達(dá)減少，導(dǎo)致細(xì)菌外膜通透性下降，使亞胺培南和第4代頭孢菌素轉(zhuǎn)運(yùn)減慢，PA對(duì)其敏感度降低，反之，則敏感度增加。據(jù)報(bào)道，美羅培南除經(jīng)OprD通道外，還可能通過其他外膜通道進(jìn)入菌體，所以O(shè)prD膜孔蛋白缺失主要引起PA對(duì)亞胺培南耐藥，對(duì)環(huán)丙沙星、氨曲南等耐藥有一定影響，而對(duì)美羅培南耐藥無影響[23]。oprD2基因突變可導(dǎo)致OprD蛋白表達(dá)降低，也能引起PA耐藥[24]。顏英俊等[25]在近期研究中發(fā)現(xiàn)，耐亞胺培南PA的oprD2基因突變率達(dá)92.3%，突變方式有點(diǎn)突變﹑插入突變等，導(dǎo)致OprD莖-環(huán)結(jié)構(gòu)與亞胺培南主要結(jié)合位點(diǎn)氨基酸發(fā)生替換和移碼突變，從而使PA對(duì)亞胺培南耐藥。有研究認(rèn)為，單純oprD2基因缺失僅引起PA對(duì)亞胺培南低水平耐藥，但與其他耐藥機(jī)制如產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶、主動(dòng)外排機(jī)制等協(xié)同作用時(shí)，可使PA對(duì)亞胺培南產(chǎn)生明顯耐藥[10]。

3 生物膜的形成

細(xì)菌生物膜(bacterial biofilm)是指細(xì)菌黏附于惰性或活性實(shí)體表面、繁殖、分化并分泌大量胞外多聚基質(zhì)從而形成的微菌落聚集體，是細(xì)菌相互粘連并將其自身包裹其中形成的膜樣物，可逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)和抗菌藥物的殺滅作用，致使慢性感染性疾病反復(fù)發(fā)作且難以控制。PA為易形成生物膜的條件致病菌。近年研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌生物膜的形成與PA耐藥密切相關(guān)，是導(dǎo)致醫(yī)院抗菌治療失敗的重要因素之一[26]。生物膜對(duì)抗生素耐藥涉及多種機(jī)制，主要有以下幾種：①生物膜形成后，細(xì)菌處于一種非生長狀態(tài)，對(duì)抑制其生長的抗生素不敏感；②生物膜形成一屏障，導(dǎo)致抗菌藥物難以滲透；③生物膜減低機(jī)體對(duì)細(xì)菌的免疫力，減弱機(jī)體與抗菌藥物的協(xié)同殺菌作用[27]；④生物膜表面的β-內(nèi)酰胺酶及其高度可誘導(dǎo)性導(dǎo)致在有誘導(dǎo)作用的抗菌藥物存在時(shí)酶產(chǎn)量高度增加[28,29]。臨床分離的產(chǎn)生物膜PA在大量黏液物質(zhì)存在下，往往使常規(guī)藥敏試驗(yàn)難以達(dá)到質(zhì)量要求，導(dǎo)致結(jié)果不可靠。

4 主動(dòng)外排泵表達(dá)的變化

主動(dòng)外排泵廣泛存在于革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和真菌中，在多重耐藥中起重要作用，是導(dǎo)致PA耐藥的重要原因之一。目前在PA中已發(fā)現(xiàn)7種外排泵，6種屬耐藥-生節(jié)-分裂(resistance-nodulation-division，RND)類的藥物外排泵系統(tǒng)[30]。它們可在天然野生菌株中表達(dá)或由于基因突變而誘導(dǎo)表達(dá)，從而介導(dǎo)對(duì)β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類及四環(huán)素類抗菌藥物的耐藥。每一主動(dòng)外排泵都由3種蛋白即外膜蛋白、內(nèi)膜蛋白和連接蛋白(又稱膜融合蛋白)組成，形成一橫貫細(xì)菌內(nèi)膜與外膜的通道，介導(dǎo)抗菌藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)和外排。如果主動(dòng)外排泵蛋白表達(dá)增多，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)加快，排出增多，菌體內(nèi)藥物難以達(dá)到有效濃度，不能很好發(fā)揮作用，細(xì)菌就會(huì)產(chǎn)生耐藥。PA有4種外排泵(即MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN和MexXY-OprM)與耐藥關(guān)系密切。這些外排泵中尤其以MexAB-OprM系統(tǒng)的作用底物范圍最廣，在耐藥形成中起主要作用。MexAB-OprM系統(tǒng)區(qū)別于其他泵的主要特點(diǎn)是能轉(zhuǎn)運(yùn)大量β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物。碳青霉烯類藥物對(duì)多數(shù)β-內(nèi)酰胺酶比較穩(wěn)定，而PA對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥常與主動(dòng)外排泵過度表達(dá)有關(guān)[20,31]。劉永芳等[31]報(bào)道，在27株耐碳青霉烯類PA中，外排泵高表達(dá)菌株占88.9%，其中2種外排泵同時(shí)高表達(dá)的菌株占25.0%，而3種外排泵同時(shí)高表達(dá)的菌株高達(dá)54.2%。有研究發(fā)現(xiàn)，外排泵還與其他耐藥機(jī)制如細(xì)菌的藥物作用靶位改變或產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶等一起發(fā)揮明顯的協(xié)同作用，使細(xì)菌耐藥率進(jìn)一步增高[32]。

5 β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物結(jié)合蛋白的改變

青霉素結(jié)合蛋白(penicillin-binding protein，PBP)是位于細(xì)菌內(nèi)膜上的一類微小蛋白質(zhì)，Mr為30 000～150 000，因其最初發(fā)現(xiàn)時(shí)能與青霉素共價(jià)結(jié)合而命名。PBP具有酶催化活性，如高M(jìn)r PBP具有糖基轉(zhuǎn)移酶和肽基轉(zhuǎn)移酶活性，低Mr PBP具有羧肽酶活性，參與細(xì)菌細(xì)胞壁合成、糖肽結(jié)構(gòu)調(diào)整和形態(tài)維持等功能。PBP是β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的主要作用靶位，不同細(xì)菌其種類及含量均不相同。β-內(nèi)酰胺類藥物通過與PBP結(jié)合使PBP喪失酶活性，細(xì)菌細(xì)胞壁無法形成而引起溶菌，從而達(dá)到殺滅細(xì)菌的作用；若PBP結(jié)構(gòu)或數(shù)量發(fā)生改變，抗菌藥物不能與之結(jié)合或親和力降低，細(xì)菌便會(huì)產(chǎn)生耐藥。對(duì)PBP耐藥機(jī)制研究報(bào)道較多的細(xì)菌是肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌，但臨床和實(shí)驗(yàn)室均發(fā)現(xiàn)耐藥PA中有PBP改變的現(xiàn)象存在[33]。每種細(xì)菌一般含有多種PBP，PA中有8種不同的PBP，分別為PBP1a、PBP1b、PBP2、PBP3、PBP3a、PBP4、PBP5/6和PBP7，大小不等。高M(jìn)r PBP的改變是細(xì)菌耐PBP機(jī)制的主要因素。但在PA中，低Mr PBP改變可能對(duì)細(xì)菌耐藥性也有影響。PBP2是多種β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的結(jié)合位點(diǎn)，有文獻(xiàn)報(bào)道PA中編碼PBP2蛋白的基因pbpA突變使PBP2蛋白表達(dá)減少，導(dǎo)致PA對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥[34]。而PBP4結(jié)構(gòu)改變可能與PA對(duì)亞胺培南耐藥有關(guān)[35]。Giske等[36]報(bào)道，PA中PBP2和PBP3表達(dá)降低可導(dǎo)致PA對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥。有意義的是，有研究發(fā)現(xiàn)PA中編碼PBP4蛋白的基因dacB失活會(huì)導(dǎo)致PA過度表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶AmpC[37]。

6 整合子的作用

整合子是具有位點(diǎn)特異性的基因重組系統(tǒng)，在病原菌的基因重組中起重要作用。整合子可識(shí)別、捕獲并攜帶耐藥基因，使耐藥基因在菌種、菌株間水平傳播，加快臨床上多藥耐藥性菌株形成。已有研究發(fā)現(xiàn)，整合子和轉(zhuǎn)座子可介導(dǎo)細(xì)菌各種耐藥基因，獲得整合子和轉(zhuǎn)座子的細(xì)菌可表現(xiàn)為多藥耐藥性。Ⅰ型整合子是造成PA 耐藥傳播的重要原因[38,39]。Ⅰ型整合子5′端保守區(qū)序列為整合酶基因和啟動(dòng)子序列，3′端保守區(qū)序列為耐消毒劑和磺胺基因(qacE△1-sul1)，通過位點(diǎn)特異性基因重組機(jī)制使整合酶從周圍環(huán)境捕獲耐藥基因，如β-內(nèi)酰胺酶﹑金屬酶，并將其組裝在一起，形成耐藥基因組合和排列，使細(xì)菌具有耐藥及多重耐藥特性。Ⅰ型整合子常見于臨床分離的革蘭陰性桿菌。最近姜習(xí)新[40]對(duì)35株多重耐藥PA的耐藥基因調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型整合子的檢出率為31.4%，且Ⅰ型整合子陽性菌株對(duì)臨床常用抗菌藥物，尤其是對(duì)β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥率明顯增高；同時(shí)該研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型整合子陽性菌株多具有多重耐藥特性，并攜帶2種或3種耐藥基因，參與PA多重耐藥的形成。

7 結(jié)語

綜上所述，PA對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，傳播機(jī)制也比較特別。PA具有天然耐藥性和獲得耐藥性，且常是多種機(jī)制協(xié)同作用的結(jié)果，而多種耐藥機(jī)制導(dǎo)致多重耐藥菌株甚至泛耐藥菌株的產(chǎn)生，給臨床治療和院內(nèi)感染控制帶來很大困難。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和創(chuàng)新，新的抗菌藥物相繼問世并使用，還將不斷有新的耐藥機(jī)制出現(xiàn)。因此，加強(qiáng)PA對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥及傳播機(jī)制的研究，對(duì)合理使用該類抗生素，有效遏制細(xì)菌感染，控制耐藥菌株出現(xiàn)有重要意義。

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