陳麗媛，徐 沖

(遼寧省微生物科學研究院，遼寧 朝陽 122000)

自然界中微生物的種數(shù)估計有10萬種，但發(fā)現(xiàn)的僅為10%～20%，而在人類生產(chǎn)和生活中僅開發(fā)利用了已發(fā)現(xiàn)微生物種類的1%，絕大多數(shù)在現(xiàn)有條件下還不能被培養(yǎng)出來。依照現(xiàn)有的培養(yǎng)技術(shù)和方法，不同生境微生物可培養(yǎng)率的檢測結(jié)果如下:海水中約為0.001% ～0.1%，淡水中約為0.25%，土壤中約為0.3%，活性污泥中約為1% ～15%。為了克服現(xiàn)有培養(yǎng)技術(shù)方法的局限性，研究人員在提出改進現(xiàn)有微生物培養(yǎng)措施的同時，相繼開發(fā)出一系列新的微生物培養(yǎng)方法和技術(shù)，如稀釋培養(yǎng)法和高通量培養(yǎng)法、擴散盒培養(yǎng)法以及細胞微囊包埋技術(shù)等，大大提高了微生物培養(yǎng)的數(shù)量和種類，對微生物資源的開發(fā)及利用具有重要意義。

1 微生物難培養(yǎng)生長的原因

1.1 自然環(huán)境的難模擬性

地球上微生物無處不在。如，每克肥沃的土壤約含20億個微生物，而每克貧瘠的土壤也含3億～5億個微生物;一只手含4萬～40萬個細菌，洗凈后約含300個細菌;在85 km的高空、11 km的深海、2 km的地層以及100℃的溫泉、－250℃低溫環(huán)境均有微生物的存在。微生物生存的環(huán)境類型也是多種多樣的，除了普通的自然環(huán)境外，還存在著各種極端環(huán)境，盡管人們已經(jīng)從中分離出一些微生物種群，然而由于極端環(huán)境復雜多變，在目前的條件和設備下，自然環(huán)境中微生物生長所需要的各種適宜條件在實驗室還無法被完全滿足，而為了達到研究的目的，通常簡化了培養(yǎng)條件。如，由于不了解或不完全了解微生物生長所需的營養(yǎng)成分及某些特定的化學物質(zhì)，將微生物接種于只具有固定配方的凝固的平板或靜止的液體培養(yǎng)基中，并置于恒溫、恒濕、黑暗等單一環(huán)境中，這樣就可能造成那些在自然界中可以生長繁殖的微生物，在純培養(yǎng)中生長條件得不到滿足，從而導致了微生物的不可培養(yǎng)性。

1.2 微生物間的相互關(guān)系

在自然界中，多種微生物組成了各種集體環(huán)境，它們相互協(xié)作，共同完成了各種復雜的物質(zhì)和能量代謝。微生物間的相互關(guān)系雖然很多，但主要可以歸納為種間的共生關(guān)系及群體感應。微生物群體之間提供生長所需的生長因子，或通過感知外界環(huán)境的變化，來調(diào)整群體行為。這些關(guān)系是微生物生長所必需的。但人們在進行常規(guī)的微生物分離培養(yǎng)過程中，通常會忽視這些群體效應，當微生物從天然環(huán)境驟然轉(zhuǎn)入人為設置的培養(yǎng)環(huán)境時，原生境中的生態(tài)依存關(guān)系遭到破壞，菌群間的生物信息交流體系也會發(fā)生根本性的改變，適應性強的物種生長迅速，而生長緩慢的微生物類型則因營養(yǎng)物的匱乏以及種群信息流通的障礙而受到抑制。

1.3 人工營養(yǎng)基質(zhì)濃度過高或氧化環(huán)境壓力的影響

以傳統(tǒng)方法培養(yǎng)時，通常采用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，以期達到微生物快速生長和最大生物產(chǎn)量，結(jié)果分離的大多為生長迅速且偏愛豐富營養(yǎng)的微生物。而在自然界中，除了一些利用高濃度營養(yǎng)物的微生物種群外，其余大部分微生物是以中低營養(yǎng)甚至是寡營養(yǎng)方式生活的。當微生物從自然環(huán)境轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)豐富的人工培養(yǎng)基時，一些攝取營養(yǎng)能力強的微生物會應運而生，而寡營養(yǎng)的微生物就會因高濃度營養(yǎng)物基質(zhì)的抑制而停止生長。另外，自然環(huán)境中的微生物在人工培養(yǎng)基上好氧條件培養(yǎng)時，一些適應性強的種類迅速生長，在生長代謝過程中產(chǎn)生大量的過氧化物、自由基和超氧化物，使生長速率較慢或適應能力較差的微生物受到毒害抑制，或者處于休眠狀態(tài)，甚至死亡。

1.4 判斷微生物生長的常規(guī)標準不完善

人們在篩選分離新的微生物菌株時，常常根據(jù)研究內(nèi)容的需要，有目的地選用固定的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行人工培養(yǎng)，營養(yǎng)成分相對單一。在自然條件下，往往是幾種甚至許多微生物混雜在一起，而在實驗室條件下接種到人工培養(yǎng)基時，那些適合人工培養(yǎng)條件的微生物攝取了大量營養(yǎng)成分，生長迅速，而生長緩慢的微生物的生長受到了抑制，而用現(xiàn)有的判斷微生物生長狀況的常規(guī)標難以觀察到這些微生物的生長，被認為“不可培養(yǎng)”。

2 微生物培養(yǎng)技術(shù)的改良措施

目前，實驗室使用的常規(guī)培養(yǎng)基多為高濃度營養(yǎng)基質(zhì)。事實上，有研究發(fā)現(xiàn)低濃度基質(zhì)培養(yǎng)出的細菌數(shù)量和種類均多于高濃度基質(zhì)［1-2］。但濃度過低也會降低微生物的培養(yǎng)數(shù)量，最適宜的濃度最好與自然界中微生物生長的環(huán)境條件相近。例如，在培養(yǎng)土壤微生物時加入土壤浸提液、培養(yǎng)海洋微生物時加入含有少量生長因子的天然海水，可以大大提高所培養(yǎng)微生物的數(shù)量及種類［3］。還可通過減少培養(yǎng)環(huán)境中的氧分壓、以多聚物為碳源、在培養(yǎng)過程中加入可降解毒性氧的物質(zhì)等，不同程度地減弱毒性氧的毒害作用［4］。另外，以下措施也可有效提高微生物的培養(yǎng)幾率。如，通過適當延長培養(yǎng)時間，有可能使某些“寡營養(yǎng)菌”肉眼可見，但培養(yǎng)時間越長，對培養(yǎng)環(huán)境的無菌要求就越高，因此培養(yǎng)時間不能無限延長;用古蘭糖膠作為培養(yǎng)基固化劑，可以避免瓊脂對某些微生物的毒性作用，增加微生物的可培養(yǎng)性［5］;在微生物培養(yǎng)過程中，供應微生物所需的特有底物(如電子供體和受體)，可有助于微生物的正常生長，從而可能發(fā)現(xiàn)未知的生理型微生物［6-7］。

3 開發(fā)新型培養(yǎng)技術(shù)

3.1 稀釋培養(yǎng)法和高通量培養(yǎng)法

由于海洋環(huán)境中主要是寡營養(yǎng)微生物類群，迄今為止海洋環(huán)境中可以培養(yǎng)的微生物的比例仍是地球環(huán)境中最低的，因此在人工培養(yǎng)時，它們就會受到來自同一環(huán)境中處于生長優(yōu)勢的微生物的抑制而不能生長［8］。稀釋培養(yǎng)法認為，當把海水中微生物群體稀釋至痕量(103/mL)時，在海水中主要存在的寡營養(yǎng)微生物可不受少數(shù)幾種優(yōu)勢微生物競爭作用的干擾，因而主體寡營養(yǎng)微生物被培養(yǎng)的可能性會大大提高［9］。研究人員在稀釋培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上又研究出高通量培養(yǎng)法，即將樣品稀釋至痕量后，采用小體積48孔細胞培養(yǎng)板分離培養(yǎng)微生物。該方法不僅有效提高了微生物的可培養(yǎng)性，還可在短期內(nèi)監(jiān)測大量的培養(yǎng)物，大大提高了工作效率［10］。

3.2 擴散盒培養(yǎng)法

擴散盒是Kaeberlein等［11］在分離培養(yǎng)潮間帶底泥微生物時使用的一種自制培養(yǎng)儀器，其最大的特點是有效地保證了微生物群落間作用的存在，可比較真實地模擬微生物所處的自然環(huán)境，提高微生物可培養(yǎng)性。應用此種改進技術(shù)，研究者從環(huán)境樣品中分離出許多常規(guī)方法很難分離的微生物。應當指出，擴散盒技術(shù)初次培養(yǎng)獲得的微小菌落多數(shù)為混合培養(yǎng)，通常需要再次分離，才能獲得純培養(yǎng)。該種方法的特點是:模擬自然環(huán)境，不同細胞間經(jīng)過互喂形成獨立的菌落。擴散盒法的主要不足是操作比較繁瑣。

3.3 細胞微囊包埋技術(shù)

細胞微囊包埋法是近年來出現(xiàn)的一種將單細胞包埋培養(yǎng)與流式細胞儀檢測結(jié)合為一體的高通量分離培養(yǎng)技術(shù)。Zengler等［12］先將土壤樣品中的微生物進行稀釋，與融化的瓊脂糖混合，然后在專門的攪拌器中用油乳化，形成直徑30～50 μm的微滴，其中10%的膠滴會含有單個細胞。之后，將包埋膠囊裝入層析柱內(nèi)，層析柱進口端用0.1 μm濾膜封住，防止外部細菌的進入而污染層析柱，出口端用8 μm濾膜封住，低濃度的有機物培養(yǎng)液連續(xù)通過層析柱對包埋膠囊進行流態(tài)培養(yǎng)，未被包埋的游離細胞則隨培養(yǎng)液流出柱外。結(jié)合流式細胞儀進行檢測，將長有單菌落的膠囊分選到加有豐富培養(yǎng)基的96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，最終獲得純培養(yǎng)微生物。該種高通量的培養(yǎng)技術(shù)可從每個樣品中分離出10000多株細菌和真菌［13］。Ben-Dov等［14］研究出一種雙層包埋技術(shù)，先將微生物包裝在瓊脂球內(nèi)，外面用一種多羰基高分子膜包裹，將這種雙層包裹的小球放在一種雌性石芝珊瑚的表面黏液層中培養(yǎng)，獲得許多新的微生物，與已知細菌序列比較，最大相似性只有85%～96%。Nichols等［15］設計了一種高通量的微生物分離芯片(Ichip)方法，每個芯片包含有數(shù)百個微型擴散孔，每個擴散孔只含有一個微生物細胞。采用該種芯片裝置，分離到大量的海水和土壤微生物，其中序列最大相似性小于95%的新種分別占28.3%和28.7%。細胞微囊包埋法的優(yōu)點:在接近于天然生長的環(huán)境中有效地提高了微生物的可培養(yǎng)性。

4 小結(jié)

近年來，新穎的微生物培養(yǎng)方法和技術(shù)陸續(xù)問世，大體可歸納為兩類:一是在傳統(tǒng)的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)方式上進行改良，包括添加微生物相互作用的信號分子，供應新型的電子供體和受體，降低營養(yǎng)基質(zhì)濃度，延長培養(yǎng)時間以改善微生物的培養(yǎng)條件，促進低營養(yǎng)以及寡營養(yǎng)微生物種類的分離培養(yǎng)等;二是設計仿原生境的高通量微生物培養(yǎng)技術(shù)和裝置，如用于海洋環(huán)境和陸生環(huán)境的擴散盒技術(shù)、土壤基質(zhì)膜技術(shù)以及高通量的細胞微囊包埋技術(shù)等。這些技術(shù)的研發(fā)極大地豐富了可培養(yǎng)微生物種群多樣性的資源寶庫，并為開發(fā)這些微生物資源奠定了良好的研究基礎(chǔ)。然而，由于微生物生存環(huán)境極其復雜，未培養(yǎng)微生物數(shù)量巨大，種類繁多，因此，在探索微生物學領(lǐng)域的過程中仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)。

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