原 野，楊 松，薛 坤，劉思楠，鄒婷婷，金 紅

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

流行性感冒病毒(influenza virus)屬于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，分為甲、乙、丙3型。甲型流感病毒常常感染人并導(dǎo)致嚴(yán)重疾病，在人群中迅速傳播，成為威脅人類(lèi)健康的常見(jiàn)病原體之一。由于流感病毒是分節(jié)段的RNA病毒，容易發(fā)生錯(cuò)配的RNA依賴(lài)的RNA聚合酶和基因重組導(dǎo)致抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換，尤其是表面糖蛋白抗原-血凝素(hemagglutinin，HA)最易發(fā)生變異，使流感在人群中不斷形成流行［1］。2009年A/H1N1型流感的爆發(fā)再次引起全球的關(guān)注［2］。目前使用的抗流感疫苗只含幾種常見(jiàn)流行株，主要是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生HA特異性中和抗體，只對(duì)所含型別有效，對(duì)預(yù)防變異株感染無(wú)效。世界衛(wèi)生組織根據(jù)每年流感流行情況，對(duì)疫苗組合進(jìn)行調(diào)整，而疫苗的研制常常滯后于流感病毒抗原的變異。所以，研發(fā)可以抵御多種流感病毒感染，減輕感染的嚴(yán)重性并且在爆發(fā)時(shí)限制疾病的傳播的“通用型”疫苗成為對(duì)科學(xué)界的挑戰(zhàn)［3］。流感病毒感染誘導(dǎo)產(chǎn)生以系統(tǒng)和局部抗體反應(yīng)為代表的特異性體液免疫以及以特異性T細(xì)胞反應(yīng)為代表的細(xì)胞免疫，二者對(duì)宿主抗病毒感染都很重要。因?yàn)獒槍?duì)疫苗產(chǎn)生的特異性抗體，不能阻止已發(fā)生變異的流感病毒感染，研究人員開(kāi)始考慮能否通過(guò)提高細(xì)胞免疫的方法，達(dá)到預(yù)防異型流感病毒感染的目的。哪種細(xì)胞免疫反應(yīng)在抗異型流感病毒免疫中起主要作用，其機(jī)制是什么，目前無(wú)統(tǒng)一的結(jié)論。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，異型流感病毒間存在部分交叉保護(hù)作用，而且IL-2可以提高異型流感病毒感染組的生存率。為探討其機(jī)制，本研究重點(diǎn)研究異型流感病毒感染前后病毒載量，T淋巴細(xì)胞增殖活性和IFN-γ陽(yáng)性CD3+CD8+淋巴細(xì)胞及IFN-γ陽(yáng)性CD3+CD4+淋巴細(xì)胞水平的變化。希望能為制備“通用型”流感疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠，雌性。

1.1.2 病毒 A/FM/47(H1N1)流感病毒株，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，用雞胚進(jìn)行增毒及病毒滴定。

1.1.3 試劑 A/H5N1流感病毒全疫苗(遼寧益康生物制品有限公司);Trizol(invitrogen);TaKaRa PCR試劑盒;MTT試劑(碧云天);Foxp3 Staining Buffer Set(EBioscience);抗體(Becton Dickinson公司)等。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)1組(同型組):用 A/H1N1型流感病毒免疫，A/H1N1型流感病毒感染;實(shí)驗(yàn)2組(異型組):用A/H5N1型流感病毒疫苗免疫，A/H1N1型流感病毒感染;實(shí)驗(yàn)3組(異型加強(qiáng)型組):用A/H5N1型流感病毒疫苗+IL-2免疫，A/H1N1型流感病毒感染;對(duì)照1組:用PBS代替疫苗，A/H1N1型流感病毒感染;對(duì)照2組:只注射IL-2，再感染A/H1N1型流感病毒;對(duì)照3組:正常飼養(yǎng)，不做任何處置。

1.2.2 感染及免疫動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)1組(同型組)以半數(shù)雞胚感染量EID50為103的A/H1N1流感病毒50 μL鼻腔接種免疫;實(shí)驗(yàn)2組和實(shí)驗(yàn)3組(異型組和異型加強(qiáng)組)A/H5N1型疫苗接種按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每只小鼠鼻腔接種50 μL;應(yīng)用IL-2組參照文獻(xiàn)［4］及試劑說(shuō)明書(shū)，使用疫苗的同時(shí)經(jīng)腹腔注射 rIL-2，0.3 mL(1 萬(wàn)單位)連續(xù)注射 0、1、2 d。首次免疫3周后加強(qiáng)免疫1次，方法劑量同上。加強(qiáng)免疫2周后，按上述分組每只小鼠經(jīng)鼻腔感染 EID50為104.8的 A/H1N1流感病毒 100 μL。正常飲食飲水飼養(yǎng)，感染病毒后每天準(zhǔn)確稱(chēng)量小鼠體重，觀察飲食飲水及精神狀態(tài)。

1.2.3 Real-Time RT-PCR 法測(cè)定病毒量 感染病毒后5 d取肺，研磨肺組織，用Trizol提取RNA，按照TaKaRa PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA合成，用ABI-C500 PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。5'-CTGAGAAGCAGGTACTGGGC-3'(有義鏈)和 5'-CTGCATTGTCTCCGAAGAAAT-3'(反義鏈)為本實(shí)驗(yàn)選用的引物。

1.2.4 MTT法測(cè)定T淋巴細(xì)胞增殖活性 分別于感染前、感染后5、7 d無(wú)菌解剖小鼠取脾，常規(guī)分離脾細(xì)胞;調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至5×106/mL，加至96孔板中，100 μL/孔，每個(gè)測(cè)試設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置陰性空白對(duì)照孔;分別加入含5 μg/mL ConA的完全 RPMl-1640培養(yǎng)液100 μL/孔，置37℃，5%C02培養(yǎng)箱孵育68 h;各孔吸出100 μL上清，按照MTT試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行;酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定各孔A值。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定 IFN-γ 陽(yáng)性 CD3+CD8+/CD4+淋巴細(xì)胞水平 分別于感染前、感染后5、7、14 d無(wú)菌解剖小鼠取脾，常規(guī)分離脾細(xì)胞，配制成1×107濃度的脾細(xì)胞懸液;向100 μL體系中加入事先配制好的孵育刺激物和阻斷劑的混合物 10 μL(PMA、Ionomycin、Monensin)，在 37℃，5%CO2溫箱中孵育5 h;向?qū)嶒?yàn)管中加入CD3e-PerCP、CD8a-PE、CD4-PE 進(jìn)行表面染色，反應(yīng)30 min;實(shí)驗(yàn)管加入破膜劑1 mL，4℃，避光孵育 60 min，洗滌2 遍;加入10 μL IFN-γ-FITC 抗體進(jìn)行胞內(nèi)染色，4℃，避光，至少30 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)數(shù)據(jù)用CELLQUEST軟件(Bec-ton Dickinson公司)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Real-Time RT-PCR法測(cè)定病毒量

感染5 d后，肺病毒量同型組最低，為103.66，異型組為 106.69，異型加強(qiáng)組為 106.02，明顯低于PBS組107.70(P﹤0.05)。說(shuō)明異型免疫可以產(chǎn)生交叉保護(hù)免疫，降低感染后肺病毒量(圖1)。

2.2 MTT法測(cè)定T淋巴細(xì)胞增殖活性

MTT法測(cè)定T淋巴細(xì)胞增殖活性見(jiàn)表1。異型組和異型加強(qiáng)組在病毒感染后5 d T淋巴細(xì)胞增殖活性明顯高于感染前，且病毒感染后7d繼續(xù)升高;與同型組和用PBS代替疫苗對(duì)照組差別顯著(P ﹤0.05)。

圖1 肺病毒量(10n)Fig.1 The virus load of lung(10n)

表1 T淋巴細(xì)胞增殖活性(A值)Table 1 The proliferous ability of T lymphocytes(A)

2.3 IFN-γ 陽(yáng)性 CD3+CD8+/CD4+淋巴細(xì)胞水平

圖2 IFN-γ陽(yáng)性CD3+CD4+淋巴細(xì)胞水平Fig.2 The level of IFN-γ-secretion CD3+CD4+T lymphocyte

病毒感染后5 d，異型組和異型加強(qiáng)組IFN-γ陽(yáng)性CD3+CD4+淋巴細(xì)胞水平明顯高于感染前(P﹤0.05)，感染后7 d出現(xiàn)高峰，在感染后14 d回落，并與同型組差別顯著;IFN-γ陽(yáng)性 CD3+CD 8+淋巴細(xì)胞水平變化與IFN-γ陽(yáng)性CD3+CD4+淋巴細(xì)胞水平相似，另外，異型加強(qiáng)組與異型組差別顯著 (P﹤0.05)，IL-2加強(qiáng)該變化。說(shuō)明感染后異型感染組Th1類(lèi)CD4淋巴細(xì)胞和IFN-γ陽(yáng)性CD3+CD8+淋巴細(xì)胞水平升高，并有時(shí)間限制性;IL-2可以加強(qiáng)異型流感病毒感染后IFN-γ陽(yáng)性CD3+CD8+淋巴細(xì)胞水平。

圖3 IFN-γ陽(yáng)性CD3+CD8+淋巴細(xì)胞水平Fig.3 The level of IFN-γ-secretion CD 3+CD8+T lymphocyte

3 討論

流感病毒變異快、流行廣，成為現(xiàn)階段最主要的公共衛(wèi)生威脅之一。目前比較有效的干預(yù)措施就是疫苗接種，而現(xiàn)有的疫苗都是株特異性的，主要介導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫，應(yīng)用中存在保護(hù)效果差和對(duì)變異株無(wú)效等諸多缺陷，進(jìn)而促使新型、高效的通用型流感疫苗的研制。自從1981年Lamb RA等［5］發(fā)現(xiàn)甲型流感病毒的基質(zhì)蛋白M2以來(lái)，以M2蛋白作為抗原研究通用流感疫苗的重要性日益受到重視。Jegerlehner A等［6］用 M2e-HBc免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)的抗M2e抗體具有保護(hù)作用，但抗體不能直接有效地與病毒結(jié)合和中和病毒，而是通過(guò)抗體依賴(lài)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用(Ab-dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC)發(fā)揮作用。很早就發(fā)現(xiàn)流感病毒核蛋白NP亦為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)反應(yīng)的主要靶抗原，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，產(chǎn)生亞型間的交叉免疫保護(hù)作用［7］。對(duì)其流感病毒編碼的各種蛋白質(zhì)中存在的CD4+和CD8+T細(xì)胞表位亦有研究報(bào)道［8-10］。因此，研究細(xì)胞免疫在抗流感病毒感染中的作用及作用機(jī)制成為研發(fā)新型流感疫苗的基礎(chǔ)。

T細(xì)胞作為免疫效應(yīng)細(xì)胞主要行使兩方面功能［11］，首先作為抗原特異的T細(xì)胞，直接發(fā)揮效應(yīng)功能，例如CTL溶解特異性靶細(xì)胞;同時(shí)，T細(xì)胞又是免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞［12］，具有輔助其他免疫細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的功能，在機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫誘導(dǎo)中均有重要作用。CD4+T淋巴細(xì)胞識(shí)別MHCⅡ類(lèi)分子所提呈外源性抗原肽，活化后主要可以分為T(mén)h1和Th2，其中Th1主要分泌 IL-2、IFN-γ、TNF-β，主要介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用和炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答，在機(jī)體細(xì)胞免疫中發(fā)揮重要作用。殺傷性T細(xì)胞(CTL)，受MHCⅠ類(lèi)分子的嚴(yán)格限制，具有特異性、程序性和快速性的特點(diǎn)，通過(guò)識(shí)別啟動(dòng)、增殖分化及效應(yīng)階段對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行殺傷。本研究顯示，免疫后流感病毒感染，使T淋巴細(xì)胞的增殖活性明顯增高，高于未免疫感染組。說(shuō)明再次感染流感病毒時(shí)導(dǎo)致淋巴細(xì)胞增殖，引起T細(xì)胞免疫。另外，異型流感病毒感染后Th1類(lèi)CD4+淋巴細(xì)胞和 IFN-γ+CD3+CD8+淋巴細(xì)胞明顯增多，在感染后7 d急劇增加，而在感染后14 d又急劇回落到感染前的靜息狀態(tài)，與同型組比較差異顯著。Zhang W等［13］認(rèn)為抗原肽刺激后表達(dá)IFN-γ的CD3+CD8+淋巴細(xì)胞就可以視為抗原肽特異性CTL。而Wang KS等［14］則認(rèn)為IFN-γ的產(chǎn)生有利于抗病毒感染保護(hù)性免疫。

IL-2是活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的Th1細(xì)胞因子，此外CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞也可產(chǎn)生［15］。雖然沒(méi)有直接的抗病毒活性，但I(xiàn)L-2具有免疫調(diào)節(jié)活性，對(duì)于免疫反應(yīng)是必需的，是機(jī)體免疫應(yīng)答的核心因子之一。本研究進(jìn)行了應(yīng)用IL-2后抗異型流感病毒感染組的研究，結(jié)果表明，應(yīng)用IL-2的異型流感病毒感染組IFN-γ陽(yáng)性細(xì)胞占 CD3+CD8+淋巴細(xì)胞的數(shù)量比單純異型流感病毒組及只使用IL-2組有顯著性差異。表明，IL-2在抗異型流感病毒感染時(shí)，促進(jìn)CTL的增殖和分化，或者說(shuō) IL-2誘導(dǎo) CTL 產(chǎn)生 IFN-γ。Sun K 等［16］認(rèn)為，Ⅱ型干擾素是流感病毒感染后巨噬細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)因子，包括下調(diào)清道夫受體MARCO(膠原樣巨噬細(xì)胞受體)以及促使巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的病原體的吞噬和清除作用。這些都為新型疫苗的研發(fā)提供新思路。

本研究表明，異型流感病毒感染后激發(fā)T淋巴細(xì)胞的增殖活性，其CTL及Th1淋巴細(xì)胞增殖活性高于同型流感病毒，并有時(shí)間限制性。IL-2則可以加強(qiáng)異型流感病毒感染后CTL的增殖活性。本研究為探討機(jī)體抗異型流感病毒感染機(jī)制及制備通用的、高效的抗流感疫苗提供了新思路。

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