楊志蕃，延 娟，劉 軍，曹雅明，王慶輝*

(1.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院腎內(nèi)科，遼寧 沈陽 110016;2.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110001)

瘧疾是瘧原蟲通過媒介昆蟲蚊傳播的人類最嚴(yán)重的寄生原蟲感染性疾病。最新數(shù)據(jù)顯示，目前全世界有109個(gè)國家發(fā)生瘧疾流行，2.7億人感染，導(dǎo)致近100萬人死亡［1］。健全的免疫系統(tǒng)對(duì)抵御瘧原蟲感染至關(guān)重要。免疫系統(tǒng)的正常運(yùn)行依賴于免疫細(xì)胞間信號(hào)的有效傳遞。在機(jī)體抵御外來感染時(shí)，免疫細(xì)胞產(chǎn)生大量氧自由基抵御感染。同時(shí)，大量的氧自由基也損傷了自身的免疫細(xì)胞?？寡趸瘎﹦t能去除自由基，終止連鎖反應(yīng)并且抑制其他氧化反應(yīng)。補(bǔ)充抗氧化劑對(duì)于癌癥、冠心病等疾病具有一定的預(yù)防作用。VA、VC和VE是飲食中的重要成分，同時(shí)也是重要的抗氧化劑。VA是最早被發(fā)現(xiàn)的維生素，作為復(fù)雜機(jī)體必需的一種營養(yǎng)素，幾乎能以不同方式影響機(jī)體的一切組織細(xì)胞。VC是細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的抗氧化劑，文獻(xiàn)報(bào)道［2］，給動(dòng)物補(bǔ)飼高水平VC后，T淋巴細(xì)胞的增殖能力和吞噬細(xì)胞的吞噬作用加強(qiáng)，同時(shí)細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加，體內(nèi)抗體水平上升，從而有利于疾病的恢復(fù)。然而，多年來抗氧化劑在抗瘧原蟲感染過程中的作用一直存有爭(zhēng)議。研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充具有抗氧化活性的維生素，可有效減輕瘧疾的感染［3-4］，但也有研究顯示其不能有效阻止瘧原蟲的增殖［5-6］。目前，關(guān)于不同抗氧化劑和瘧疾之間的相關(guān)免疫機(jī)制尚不清楚。為此，本研究利用已成功建立的 P.y17XL易感鼠瘧模型，動(dòng)態(tài)地觀察了VA、VC和VE對(duì)P.y17XL易感小鼠免疫應(yīng)答的影響，以期明確其在P.y17XL感染早期的免疫調(diào)節(jié)作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及瘧原蟲 6～8周齡、雌性BALB/c小鼠由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供 (許可證編號(hào):SCXK京 200420001);P.y17XL(日本愛媛大學(xué)分子寄生蟲學(xué)教研室惠贈(zèng))。

1.1.2 主要試劑 FITC-anti-CD11c(clone HL3， BD Pharmigen)、 PE-anti-CD11b(clone M1/70，BD Pharmigen)、percp-anti-CD45R/B220(clone RA3-6B2，BD Pharmigen)、biotinylated anti-TLR9(clone 5G5，hycultbiotech)和PE-conjugated streptavidin(clone streptavidin，Biolegend)、PE-anti-MHCⅡ (M5/114.15.2，eBioscience)、FcⅢ/Ⅱ封閉抗體 (clone 2.4G2，BD Pharmigen)、VA、VC、VE(Sigma)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染 BALB/c小鼠分別經(jīng)腹腔感染 1×106P.y17XL寄生的紅細(xì)胞(pRBC)，感染不同時(shí)間小鼠經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，鏡檢計(jì)數(shù)紅細(xì)胞感染率，并每日觀察生存率。

1.2.2 動(dòng)物分組與藥物處理 BALB/小鼠隨機(jī)分為5組:大豆油處理組 (NC1組)、生理鹽水處理組 (NC2組)、50 mg/kg VA處理組 (VA組)、1 g/只VC處理組 (VC組)和600 mg/kg VE處理組 (VE組)，VA、VE溶解于大豆油中，VC溶解于生理鹽水中，分別于感染前10 d連續(xù)每天灌胃0.2 mL/只。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 無菌取出感染前(0 d)和感染后第3、5天小鼠脾臟，常規(guī)方法制備脾細(xì)胞懸液，用0.17 mol/L NH4Cl裂解紅細(xì)胞。以含10%胎牛血清(FCS)的RPMI 1640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度為1×107/mL。為檢測(cè)DCs亞群及MHCⅡ分子的表達(dá)，取0.1 mL細(xì)胞懸液經(jīng)FcrⅢ/Ⅱ封閉抗體避光封閉30 min后，分別加入FITC-anti-CD11c、 PE-anti-CD11b、 Percp-anti-CD45R/B220或 者 FITC-anti-CD11c、PE-anti-MHCⅡ，4℃避光染色30 min，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè);為檢測(cè)TLR9的表達(dá)，經(jīng)FcrⅢ/Ⅱ抗體封閉的脾細(xì)胞懸液用FITC-anti-CD11c標(biāo)記后，固定透膜，再用biotinylated anti-TLR9和 PE-conjugated streptavidin標(biāo)記細(xì)胞，并進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘧原蟲感染后原蟲血癥水平和生存率

如圖1A所示，感染后第3天，各組小鼠原蟲血癥水平均為2%～5%。隨后，與對(duì)照組小鼠相比，VA和VE組小鼠原蟲血癥水平顯著升高，感染后第6天高達(dá)70%左右;而VC組小鼠原蟲血癥水平顯著低于對(duì)照組。同時(shí)，如圖1B所示，NC1對(duì)照組小鼠在感染后第6天的生存率為70%，VE組生存率為30%，2組小鼠均于第7天全部死亡，VA組小鼠的生存率在感染后第5天只有30%，并于第6天全部死亡;NC2組小鼠在感染后第6天全部死亡，而VC組在感染后第6天生存率為100%，于第7天全部死亡。由此提示，VC可降低小鼠的原蟲血癥水平，延長生存率，而VA和VE則升高小鼠的原蟲血癥水平，降低生存率。

圖1 P.y17XL感染后不同時(shí)間的感染率 (A)和生存期 (B)Fig.1 The parasitemia(A)and survival rate(B)at different time points after P.y17XL infection

2.2 瘧原蟲感染后不同時(shí)間小鼠脾臟DCs亞群的數(shù)量

如圖2A所示，與感染前相比，各組小鼠pDCs的數(shù)量于感染后第3天開始升高，第5天達(dá)到峰值。與各自對(duì)照組相比，VA和VE組小鼠脾pDCs(CD11c+CD45R/B220+DCs)的數(shù)量顯著降低，而VC組小鼠脾pDCs的數(shù)量在感染后第5天顯著升高。如圖2B所示，各組小鼠mDCs(CD11c+CD11b+DCs)的數(shù)量的變化與pDCs的變化相似，VA和VE組小鼠脾mDCs顯著低于對(duì)照組，而VC組則高于對(duì)照組。

2.3 瘧原蟲感染后不同時(shí)間脾臟CD11c+DCs細(xì)胞TLR9的表達(dá)水平

如圖3所示，與感染前相比，各組小鼠TLR9的表達(dá)水平于感染后第5天出現(xiàn)有意義的升高。與各自對(duì)照組相比，感染后第5天，VC組TLR9的表達(dá)顯著升高，而VA和VE組則明顯降低。

2.4 瘧原蟲感染后不同時(shí)間脾臟CD11c+DCs細(xì)胞MHCⅡ的表達(dá)水平

如圖4所示，感染后第5天，VA和VE組小鼠DCs細(xì)胞的MHCⅡ分子的表達(dá)顯著低于對(duì)照組，而VC組小鼠DCs細(xì)胞的MHCⅡ表達(dá)水 平顯著高于對(duì)照組。

圖2 P.y17XL感染后不同時(shí)間小鼠脾pDCs(CD11c+CD45R/B220+)和mDCs(CD11c+CD11b+)亞群的變化Fig.2 The percentage of spleen pDCs(CD11c+CD45R/B220+)(A)and mDCs(CD11c+CD11b+)(B)at different time points after P.y17XL infection

圖3 P.y17XL感染后不同時(shí)間小鼠脾CD11c+TLR9+DCs的變化Fig.3 The percentage of spleen CD11c+TLR9+DCs at different time points after P.y17XL infection

圖4 P.y1717XL感染后不同時(shí)間小鼠脾CD11c+MHCⅡ+DCs的變化Fig.4 The percentage of spleen CD11c+MHCⅡ+DCs at different time points after P.y17XL infection

3 討 論

瘧原蟲感染后，宿主的免疫應(yīng)答發(fā)生時(shí)相和強(qiáng)度明顯影響著感染進(jìn)程和最終結(jié)局。我們前期的研究結(jié)果表明，BALB/c感染P.y17XL后不能有效地建立Th1免疫應(yīng)答控制紅內(nèi)期瘧原蟲的爆發(fā)性增殖，進(jìn)而導(dǎo)致小鼠死亡［7］。因此，誘導(dǎo)有效的抗瘧免疫十分重要。本研究通過對(duì)P.y17XL易感的BALB/c小鼠進(jìn)行3種具有抗氧化活性的維生素預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VC補(bǔ)充后，感染率和死亡率均降低;然而，補(bǔ)充VA、VE后，感染率和死亡率均升高，進(jìn)一步加重瘧疾感染。

作為活化初始T細(xì)胞的唯一抗原提呈細(xì)胞-DCs，在固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答協(xié)調(diào)建立過程中起到了關(guān)鍵的橋梁作用［8］。同時(shí)，TLR是固有免疫系統(tǒng)的重要組成成分，在許多感染性疾病中TLR是識(shí)別入侵病原微生物(包括原蟲)、介導(dǎo)固有免疫細(xì)胞活化的重要模式識(shí)別受體［9］。DCs可通過TLR識(shí)別不同的病原微生物，進(jìn)而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的建立［10］。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)充VC可增加DCs亞群的數(shù)量，并提高TLR-9及MHCⅡ的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)DCs的活化，進(jìn)一步強(qiáng)化Th1免疫應(yīng)答，推遲感染進(jìn)程。然而，補(bǔ)充VA、VE則抑制DCs的數(shù)量和功能，進(jìn)一步加劇感染。

綜上所述，在瘧疾感染中，不是所有具有抗氧化活性的維生素均能夠抑制瘧疾的發(fā)生發(fā)展，有針對(duì)性地正確選擇抗氧化劑，才能有效地調(diào)控瘧原蟲感染進(jìn)程。

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