趙 超，張寧寧，梅 凡1，，艾 超1，，阮靈偉，黃一帆 ，劉 斌*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002;2.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002;3.福建農(nóng)林大學(xué)生物能源研究所，福建福州 350002;4.國家海洋局第三海洋研究所海洋生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361005)

木聚糖是植物半纖維素的主要成分，是自然界中僅次于纖維素的可再生生物資源，占植物細(xì)胞干重的15%～35%，是植物細(xì)胞壁的主要成分之一。木聚糖酶(EC3.2.1.8)屬水解酶類，是將木聚糖降解為低聚木糖或木糖的復(fù)合酶系。木聚糖酶是一種重要的工業(yè)用酶，廣泛應(yīng)用于生物能源、食品、釀造、飼料和造紙等工業(yè)［1］。工業(yè)化生產(chǎn)所需木聚糖酶應(yīng)是耐熱的，對(duì)具備熱穩(wěn)定性質(zhì)的木聚糖酶的研究和開發(fā)顯得非常重要。目前已報(bào)道產(chǎn)木聚糖酶的微生物有幾十個(gè)屬、一百多個(gè)種，研究和應(yīng)用最多的是細(xì)菌、曲霉和木霉產(chǎn)的木聚糖。從嗜熱環(huán)境中篩選有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的木聚糖酶的產(chǎn)生菌，是得到耐熱木聚糖酶的最有效的手段［2］。天然木聚糖酶的許多性質(zhì)不適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)的條件，酶的定向進(jìn)化能通過改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)而滿足這種需求［3-4］。耐熱木聚糖酶的定性進(jìn)化方面，國內(nèi)外研究相對(duì)較少［5］。耐熱木聚糖酶基因的體外分子進(jìn)化研究，可使原本操作起來耗時(shí)耗力或難以進(jìn)行直觀篩選的耐熱酶得到改造，以期獲得熱穩(wěn)定的木聚糖酶。本研究從福建省永泰縣溫泉中篩選到1株高產(chǎn)木聚糖酶菌株(編號(hào)為TC-W7)，通過16S rRNA序列、形態(tài)、生理生化等方面對(duì)該菌進(jìn)行了初步鑒定，并從中克隆得到耐熱木聚糖酶基因。采用定向進(jìn)化易錯(cuò)PCR的方法，對(duì)影響易錯(cuò)PCR突變率的Mg2+濃度、Mn2+濃度和dCTP/dTTP濃度等條件展開優(yōu)化，向該木聚糖酶基因隨機(jī)引入突變，為后續(xù)耐熱木聚糖酶的定向進(jìn)化研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 實(shí)驗(yàn)樣品來自于美國內(nèi)華達(dá)州溫泉和福建省永泰縣近海溫泉。

1.1.2 菌株和試劑 E.coli DH5α、載體 pMD18-T、Ex Taq DNA 聚合酶、dNTP、Mixture、dTTP、dCTP、T4 DNA Ligase(TaKaRa);100 bp DNA Ladder Maker、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、Plasmid Mini Kit、PCR產(chǎn)物純化試劑盒(TIANGEN);木聚糖(Sigma)，半纖維素自制。

1.1.3 培養(yǎng)基 ①半纖維素初篩培養(yǎng)基(g/L):(NH4)2SO40.50，KH2PO41.0，CaCl2·2H2O 0.20，MgSO4·7H2O 0.30，K2SO40.10，NaCl 0.20，瓊脂 15.0，自制半纖維素 15.0，pH 7.0 ～7.2。(半纖維素制備:取水稻秸稈磨成的粉末，按浸泡固液比1∶15，用60 g/L的NaOH于120℃浸泡2 h，過濾得濾液。將所得濾液冷卻至室溫，調(diào)pH值至7.0，加入與濾液等體積的乙醇沉淀，高速冷凍離心機(jī)5000 r/min離心5 min，沉淀物用無水乙醇洗滌離心2～3次。將所得固體物45℃下烘干，得到的粉末即為半纖維素［6］);②木聚糖復(fù)篩培養(yǎng)基(g/L):木聚糖 3.0，KNO30.10，Mg-SO4·7H2O 0.05，NaCl 0.05，K2HPO40.05，瓊脂15.0，pH 7.0 ～7.2。

1.2 方法

1.2.1 目標(biāo)菌株的分離與篩選 稱取5.0 g樣品，加50 mL滅菌生理鹽水于三角瓶中，搖床振蕩10 min。吸取1 mL用無菌生理鹽水梯度稀釋至10－4倍，取80 μL稀釋液涂布半纖維素固體培養(yǎng)基，置于70℃培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后，挑取單菌落劃線分離純化。在半纖維素初篩平板上選取透明圈相對(duì)較大菌株，接種于木聚糖復(fù)篩平板和液體培養(yǎng)基中，根據(jù)降解后透明圈形成的大小及粗酶液活性判斷降解能力。酶活性較強(qiáng)菌株添加15%甘油后，置于－80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌落形態(tài)觀察、鏡檢及生理生化測(cè)試 取目標(biāo)菌株斜面菌種，接種于復(fù)篩培養(yǎng)基，70℃培養(yǎng)24 h后，觀察并記錄菌落生長(zhǎng)狀況和菌落形態(tài)。挑取少量菌體進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察并記錄菌體形態(tài)。參考東秀珠等［7］《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株進(jìn)行部分生理生化測(cè)試。

1.2.3 酶學(xué)性質(zhì)研究(酶活測(cè)定按1.2.8) ①酶最適反應(yīng)溫度測(cè)定:取適量稀釋酶液，分別置于35、45、55、65、70、75、80、85、90、95 ℃下測(cè)定酶活;②酶的熱穩(wěn)定性測(cè)定:取適量稀釋酶液，分別置于65、70、75、80 ℃下保溫 10、20、30、40、60、80、100、120 min后，取出測(cè)定酶活;③酶的最適pH測(cè)定:取適量稀釋酶液，分別置于50 mmol/L的pH 3.2、4.2、5.2、6.2、7.2 的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，pH 8.2 的 Tris-HCl緩沖液，pH 9.2、10.2 的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，最適溫度條件下測(cè)定酶活;④酶的pH穩(wěn)定性測(cè)定:取適量稀釋酶液，置于上述pH 條件下分別耐受15、30、60、90 min后，取出測(cè)定酶活;⑤金屬離子、抑制劑和去污劑對(duì)酶活力的影響:分別配制50 mmol/L的不同金屬離子(Ni2+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Mn2+、Fe2+、Al3+)、100 mmol/L 的抑制劑(SDS、EDTA、PMSF、2-Me、DDT)和 10% 的去污劑(Tween-20、TrionX-100)溶液。取適量稀釋酶液，加入金屬離子、抑制劑和去污劑至終濃度為10 mmol/L或1%，溫浴10 min后，取出測(cè)定酶活。

1.2.4 基因組DNA的提取及16S rRNA序列擴(kuò)增 采用CTAB/NaCl法提取基因組DNA［8］，利用通用擴(kuò)增16S rRNA基因的引物27F和1492R［9］，以基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR條件:94 ℃ 5 min;94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 90 s;30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物回收，連接至載體pMD18-T，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，挑取陽性克隆子，送上海生工測(cè)序分析。將測(cè)序結(jié)果在專門收錄典型菌株的網(wǎng)站EzTaxon database進(jìn)行比對(duì)分析［10］。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析 采用EzTaxon的在線工具進(jìn)行序列比對(duì)計(jì)算相似性，并利用軟件MEGA 4.0對(duì)相應(yīng)基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹［11］，利用Clustal W進(jìn)行比對(duì)，隨后采用Neighbor-joining方法建立進(jìn)化樹，同源關(guān)系的可靠性由自舉值(bootstrap)進(jìn)行評(píng)估(1000次重復(fù))。

1.2.6 木聚糖酶基因xyn擴(kuò)增 以目標(biāo)菌株基因組DNA為模板，根據(jù)木聚糖酶基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)的兼并引物進(jìn)行交叉式PCR擴(kuò)增(表1)，回收PCR產(chǎn)物后連入pMD18-T克隆載體，挑取陽性克隆子，送上海生工測(cè)序分析。所得序列經(jīng)BLAST分析，依據(jù)與該片段比對(duì)具有最高相似性菌株中木聚糖酶基因的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，以目標(biāo)菌株基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物后連入pMD18-T克隆載體挑取陽性克隆子，送上海生工測(cè)序分析。

表1 用于PCR的引物序列Table 1 Primers used in PCR

1.2.7 易錯(cuò)PCR致突變條件優(yōu)化 普通PCR擴(kuò)增體系(50 μL)為 10 × TaKaRa Taq Buffer，dNTP Mixture，引物各 0.2 μmol/L，模板 DNA 100 ng，Taq DNA聚合酶2.5 U。PCR條件:95℃ 5 min;94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。易錯(cuò)PCR致突變條件優(yōu)化過程如下:①M(fèi)g2+致突變條件優(yōu)化:易錯(cuò)PCR其他條件不變，Mg2+分別選擇 18.0、20.0、22.0、24.0 μmol/L;②Mn2+致突變條件優(yōu)化:易錯(cuò)PCR其他條件不變，Mn2+分別添加至 0.20、0.40、0.60、0.80 μmol/L;③dTTP/dCTP致突變條件優(yōu)化:易錯(cuò)PCR其他條件不變，dTTP/dCTP分別添加至0.21、0.22、0.23、0.26、0.30 mmol/L;④根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，將影響突變率的因素組合，其他易錯(cuò)PCR的組分和擴(kuò)增條件不變，獲得適宜的突變率。

突變率的鑒定:PCR產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化后，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，所有轉(zhuǎn)化子構(gòu)成突變體文庫。隨機(jī)挑選3個(gè)陽性克隆子送上海生工測(cè)序。計(jì)算在木聚糖酶基因中平均有多少堿基發(fā)生突變，計(jì)算突變率。

1.2.8 木聚糖酶活力測(cè)定 將2.0 mL的1.0%木聚糖溶液 (pH 7.2的檸檬酸緩沖液配制)和1.5 mL的DNS加入比色管，70℃溫浴5 min，加入粗酶液0.5 mL，反應(yīng)30 min，混勻后沸水浴顯色15 min，冷卻至室溫后定容到10 mL，用分光光度計(jì)540 nm測(cè)定OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算酶活。在上述條件下1.0 mL粗酶液1 min催化水解木聚糖生成1 μmoL木糖的量，定義為1 U。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)耐熱木聚糖酶菌株的篩選與鑒定

樣品經(jīng)半纖維素初篩培養(yǎng)基篩選，得到20株透明圈相對(duì)較大的菌株，再根據(jù)木聚糖復(fù)篩培養(yǎng)基條件下木聚糖酶水解圈直徑及粗酶液酶活力比較，復(fù)篩到1株編號(hào)為TC-W7的木聚糖酶活性最大的細(xì)菌菌株。初始菌株TC-W7在木聚糖復(fù)篩培養(yǎng)基上菌落呈現(xiàn)乳白色，半透明且表面光滑，中間些許隆起、帶有透明暈環(huán)、邊緣不規(guī)則。革蘭染色為陽性，鞭毛側(cè)生。其最適生長(zhǎng)溫度為75℃，最適生長(zhǎng)pH值為8.2，在此條件下其木聚糖酶活力為215.83 U/mL。

經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得菌株TC-W7的16S rRNA基因序列，提交至NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行保存，其NCBI序列登錄號(hào)為GQ866911。采用Neighbor-joining構(gòu)建16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹，分析菌株TC-W7發(fā)現(xiàn)與Geobacillus thermodenitrificans DSM 465T及Geobacillus subterraneus 34T處于同一分支(圖1)，TC-W7的16S rRNA基因與兩個(gè)菌株的序列相似性分別為99.67%和99.20%，初步確定菌株TC-W7屬于土壤芽胞桿菌屬(Geobacillus)。

圖1 利用Neighbor-joining建樹法對(duì)菌株TC-W7系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.1 Unrooted neighbor-joining tree of strain TC-W7 and related genera based on 16S rRNA gene sequences.Bar，0.2%sequence divergence

2.2 酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

該木聚糖酶反應(yīng)的最適溫度為75℃，粗酶在65℃和70℃條件下的熱穩(wěn)定性較強(qiáng)，耐受2 h后仍有75%活性，該酶在95℃時(shí)仍具有一定的酶活。75℃時(shí)，酶的半衰期為30 min，酶的熱穩(wěn)定性能較好。該酶反應(yīng)的最適 pH為7.2，在 pH 9.2的穩(wěn)定最好，pH 9.2和10.2條件下溫育90 min后仍具有80%和42%的活性，表明該木聚糖酶具有較好的堿耐受性(圖2)。

金屬離子Ni2+、Cu2+、Zn2+對(duì)酶活具有較強(qiáng)抑制作用，分別降至初始酶活的45.0%、24.3%和66.8%，而 Mg2+、Ca2+、Ba2+、Mn2+和 Al3+對(duì)其有一定程度的促進(jìn)作用，分別提高了20.0%、16.0%、19.1%、23.4%和 16.8%，尤其是 Fe2+的促進(jìn)作用最強(qiáng)，酶活提高44.5%。抑制劑SDS、2-Me、Tween-20對(duì)酶活性的影響作用不明顯，而PMSF和EDTA則能較強(qiáng)的抑制其酶活性，分別降低到初始酶活的55.6%和25.5%，但Triton X-100和DDT能夠有效增強(qiáng)該酶的活性，酶活分別提高了45.2%和30.5%。

圖2 溫度和pH值對(duì)木聚糖酶酶活力影響Fig.2 Effects of temperature(A，C)and pH(B，D)on xylanase activity

2.3 木聚糖酶基因xyn擴(kuò)增

以TC-W7基因組DNA為模板，以木聚糖酶基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)的兼并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1條400 bp的片段，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該序列片段為木聚糖酶基因的部分序列，且與G.thermodenitrificans T-2的熱穩(wěn)定木聚糖酶具有92%的最高相似性。依據(jù)與該片段比對(duì)具有最高相似性菌株G.thermodenitrificans T-2中木聚糖酶基因的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)了引物(XynF/XynR)，PCR擴(kuò)增得到一段大約1200 bp的片段(圖3)。測(cè)序結(jié)果顯示，TC-W7木聚糖酶基因是一個(gè)1224 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼由407個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，NCBI中的序列登錄號(hào)為 GQ857066。與UniProt Knowledgebase數(shù)據(jù)庫中木聚糖酶序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該酶與G.thermodenitrificans NG80-2(A4IP71)、Geobacillus sp.WBI(B5M201)、Geobacillus sp.Y412MC61(C9RT34)、Bacillus firmus(Q6U892)中木聚糖酶的同源性分別為98%、86%、85%和57%。

圖3 以TC-W7基因組DNA為模板擴(kuò)增木聚糖酶基因電泳圖Fig.3 Electrophoregrams of the xylanase-encoding DNA amplification fragment from the strain TC-W7 chromosomal DNA

2.4 易錯(cuò)PCR致突變條件優(yōu)化

2.4.1 Mg2+、Mn2+濃度優(yōu)化 由于 Mg2+在 PCR過程中可以穩(wěn)定非互補(bǔ)的堿基對(duì)，而Mn2+能夠降低聚合酶對(duì)模板的特異性，因此可通過調(diào)整2種離子的濃度，獲得不同突變頻率的多樣性文庫。較低濃度的Mg2+對(duì)Taq DNA聚合酶是必需的，較高濃度可以穩(wěn)定非互補(bǔ)的堿基對(duì)，有利于突變。Mg2+濃度優(yōu)化結(jié)果表明，18.0 μmol/L時(shí)開始出現(xiàn)彌散，20.0 ～24.0 μmol/L 時(shí)擴(kuò)增條帶逐漸變窄變淡，24.0 μmol/L時(shí)條帶幾乎擴(kuò)增不出來(圖4A)。在20.0、22.0 μmol/L 濃度下，擴(kuò)增的突變率分別為 0.6%(7/1224)和 1.5%(18/1224)，選定20.0 μmol/L Mg2+濃度作為后續(xù)致突變條件。Mn2+可以降低聚合酶對(duì)模板的特異性。在比較不同Mn2+濃度對(duì)PCR反應(yīng)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，0.20～0.80 μmol/L梯度內(nèi)條帶清晰度均較好，但隨著Mn2+濃度的增高，條帶彌散的現(xiàn)象越來越嚴(yán)重(圖4B)，可見提高M(jìn)n2+濃度可增加突變率。在 0.6、0.8 μmol/L 濃度下，堿基突變率分別為0.5%(6/1224)和 1.2%(14/1224)，選取 0.80 μmol/L Mn2+濃度作為后續(xù)致突變條件。

圖4 不同Mg2+(A)及Mn2+(B)濃度優(yōu)化易錯(cuò)PCR結(jié)果(單位:μmol/L)Fig.4 Error-prone PCR conducted with different Mg2+(A)and Mn2+(B)concentrations(unit:μmol/L)

2.4.2 dTTP/dCTP濃度優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)在原有dNTP Mixture的基礎(chǔ)上，添加dTTP/dCTP濃度分別至0.21、0.22、0.23、0.26、0.30 μmol/L，添加至0.30 mmol/L后出現(xiàn)較為理想的渾濁度(圖5)，在該濃度條件下突變率為 0.6%(7/1244)。dNTP是反應(yīng)中磷酸根的主要來源，增大dTTP/dCTP的濃度促進(jìn)錯(cuò)誤摻入，堿基A容易被T替代，堿基G被C替代，從而提高突變率。另外，dNTP濃度的任何變化都將影響到Mg2+的有效濃度，從而影響PCR結(jié)果的忠實(shí)性［12］。

圖5 不同dTTP/dCTP濃度優(yōu)化易錯(cuò)PCR結(jié)果Fig.5 Error-prone PCR conducted with different dTTP/dCTP concentrations

2.5 不同致突變條件聯(lián)合作用對(duì)堿基突變率影響

其他易錯(cuò)PCR的組分和擴(kuò)增條件不變，同時(shí)選擇 20.0 μmol/L Mg2+、0.80 μmol/L Mn2+、0.30 mmol/L的dTTP/dCTP進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果顯示在1224個(gè)堿基中有12個(gè)堿基發(fā)生突變，突變率為0.98%，所造成的突變率在0.5% ～2.0%的范圍。43個(gè)堿基發(fā)生變化會(huì)導(dǎo)致407個(gè)氨基酸殘基中4～12個(gè)氨基酸發(fā)生突變，氨基酸突變率為0.98% ～2.95%，此突變率適合用于酶定向進(jìn)化［13］。該技術(shù)關(guān)鍵在于選擇適當(dāng)?shù)耐蛔冾l率，一般為每個(gè)基因2～5個(gè)堿基替換。只有突變庫盡量大，才能篩選到想要獲得的陽性突變子。但是如果庫容量過大，則篩選過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此獲得最佳的突變率，既可以降低篩選突變子的數(shù)量，又可以成功地獲得預(yù)期的突變子。

3 討論

本研究從溫泉中篩選到1株嗜熱脫氮土壤芽胞桿菌 Geobacillus sp.TC-W7，菌株在最適溫度75℃和 pH 8.2條件下，其木聚糖酶活力為215.83 U/mL。該木聚糖酶在溫度為75℃和pH 9.2條件下的穩(wěn)定性最好，具有較強(qiáng)的耐熱性和耐堿性。從菌株TC-W7擴(kuò)增到1224 bp的木聚糖酶基因xyn，并通過易錯(cuò)PCR的定向進(jìn)化策略，研究了xyn基因致突變條件，在Mg2+濃度為20.0 mmol/L，Mn2+濃度為 0.80 mmol/L，dTTP/dCTP濃度為0.30 mmol/L的條件下，獲得的堿基突變率為0.98%，氨基酸突變率為0.98% ～2.95%，此條件適合用于耐熱木聚糖酶的定向進(jìn)化。

Geobacillus是國際上2001年新命名的一類細(xì)菌。由于其具有嗜熱、兼性厭氧及降解烴等特性，這類細(xì)菌具有特殊的功能基因和特種酶，對(duì)構(gòu)建工程菌具有重要的研究?jī)r(jià)值［14］。天然蛋白質(zhì)分子的進(jìn)化依賴于自然選擇和變異法則，近年發(fā)展起來的酶定向進(jìn)化技術(shù)能夠開發(fā)出天然酶蛋白分子不具備的特性［15］。利用易錯(cuò)PCR重新改進(jìn)酶分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)可以逐步接近和滿足將酶催化用于工業(yè)生產(chǎn)的需要［16］。Stephens等［17］利用易錯(cuò)PCR技術(shù)提高了Thermomyces lanuginosus中木聚糖酶(XynA)的耐堿性和耐熱性。Zhang等［18］利用該技術(shù)使 G.stearothermophilus產(chǎn)木聚糖酶(xylanase XT6)的失活半壽期提高了1.4～2.5倍。易錯(cuò)PCR可使原始蛋白質(zhì)中僅有很小的序列空間發(fā)生突變，一般適用于較小的基因片段，對(duì)于定向進(jìn)化的研究者，易錯(cuò)PCR不失為一種有效、實(shí)用的進(jìn)化方法。本研究為耐熱木聚糖酶基因的突變文庫構(gòu)建，獲得高活性和熱穩(wěn)定性突變體奠定基礎(chǔ)。

［1］Beg QK，Kapoor M，Mahajan L，et al.Microbial xylanases and their industrial applications:a review［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2001，56(3-4):326-338.

［2］趙超，李婷，鄧云金，等.厭氧菌群SVY42產(chǎn)酶條件分析及產(chǎn)木聚糖酶菌株的分離鑒定［J］.微生物學(xué)雜志，2013，33(3):49-53.

［3］Belien T，Joye IJ，Delcour JA，et al.Computational design-based molecular engineering of the glycosyl hydrolase family 11 B.subtilis XynA endoxylanase improves its acid stability［J］.Protein Engineering Design and Selection，2009，22(10):587-596.

［4］Fenel F，Zitting AJ，Kantelinen A.Increased alkali stability in Trichoderma reesei endo-1，4-［beta］-xylanase II by site directed mutagenesis［J］.Journal of Biotechnology，2006，121(1):102-107.

［5］Miyazaki K，Takenouchi M，Kondo H，et al.Thermal stabilization of Bacillus subtilis family-11 xylanase by directed evolution［J］.The Journal of Biological Chemistry，2006，281(15):10236-10242.

［6］彭園花，盧紅梅，曾祥欽.半纖維素制備條件優(yōu)化［J］.環(huán)?？萍?，2007，13(1):44-46.

［7］東秀珠，蔡妙英，等.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，2001.

［8］Syn CK，Swarup S.A scalable protocol for the isolation of large-sized genome DNA within an hour from several bacteria［J］.Analytical Biochemistry，2000，278(1):86-90.

［9］Weisburg WG，Barns SM，Pelletier DA，et al.16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study［J］.Journal of Biotechnology，1991，173(2):697-703.

［10］Chun J，Lee JH，Jung Y，et al.EzTaxon:a web-based tool for the identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene sequences［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2007，57(10):2259-2261.

［11］Tamura K，Dudley J，Nei M，et al.MEGA4:Molecular evolutionary genetics analysis(MEGA)software version 4.0［J］.Molecular Biology and Evolution，2007，24(8):1596-1599.

［12］王睿，喻曉蔚，沙沖，等.定向進(jìn)化-易錯(cuò)PCR方法提高華根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2009，25(12):1892-1899.

［13］馮慧玲，李春梅，吳振芳，等.易錯(cuò) PCR技術(shù)提高黑曲霉N25植酸酶活力的研究［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2010，10:226-230.

［14］周衛(wèi)民，楊世忠，Nazina TN，等.Geobacillus研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)雜志，2005，25(3):46-49.

［15］Leisola M，Turunen O.Protein engineering:opportunities and challenges［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2007，75(6):1225-1232.

［16］Bornscheuer UT，Pohl M.Improved biocatalysts by directed evolution and rational protein design［J］.Current Opinion in Chemical Biology，2001，5(2):137-143.

［17］Stephens DE，Singh S，Permaul K.Error-prone PCR of a fungal xylanase for improvement of its alkaline and thermal stability［J］.FEMS Microbiology Letters，2009，293(1):42-47.

［18］Zhang ZG，Yi ZL，Pei XQ，et al.Improving the thermostability of Geobacillus stearothermophilus xylanase XT6 by directed evolution and site-directed mutagenesis［J］.Bioresource Technology，2010，101(23):9272-9278.