鄭 旭，張簡(jiǎn)麗，任 玥，王 杰*

(1.沈陽市和平區(qū)疾病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110034;2.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬衛(wèi)生學(xué)校，遼寧 沈陽 110034;3.沈陽醫(yī)學(xué)院 繼續(xù)教育學(xué)院，遼寧 沈陽 110034)

KDR(Kinase domain receptor，激酶功能區(qū)受體)作為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(human vascular endothelial growth factor，VEGF)最為重要的受體之一，在促進(jìn)癌生長(zhǎng)、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中起著重要作用［1］。前期研究中，本課題組利用質(zhì)粒載體和三代慢病毒載體系統(tǒng)成功構(gòu)建了靶向KDR的RNA干擾重組體，并有效抑制了肝癌細(xì)胞株HHCC、HepG2、Hep-6細(xì)胞株和小細(xì)胞型肺癌A549細(xì)胞株KDR基因的表達(dá)和遏制了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［2-3］。但是靶向KDR的RNA干擾重組體存在著在宿主細(xì)胞感染效率低，難以穿透腫瘤細(xì)胞生物屏障，毒性作用大且易造成細(xì)胞損傷甚至死亡等問題，限制了其在腫瘤治療中的廣泛應(yīng)用。TAT(transcriptional activator of transcription)是一種新近發(fā)現(xiàn)的具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能且能夠高效穿膜的短肽，為人類免疫缺陷性病毒(HIV)的重要轉(zhuǎn)錄因子［4］。研究表明，TAT可將攜帶的siRNA、蛋白質(zhì)DNA及治療性藥物高效、快速地進(jìn)入體外培養(yǎng)的細(xì)胞和體內(nèi)組織中，甚至可以透過血腦屏障，具有速度快，不依賴于溫度、能量、細(xì)胞膜抗體，且對(duì)細(xì)胞無毒性損傷等特點(diǎn)［5］。此外，TAT的核心區(qū)域僅有10個(gè)氨基酸(YGRKKRRQRRR)，分子量小，不會(huì)增加機(jī)體對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)的免疫排斥反應(yīng)［6］。因此，TAT是一種很有前途的生物活性分子轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的運(yùn)載工具。本研究構(gòu)建了TAT與KDR靶向siRNA的融合基因慢病毒載體，將TAT的穿膜作用與KDR siRNA的抗腫瘤作用相結(jié)合，通過體外實(shí)驗(yàn)研究，觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞的穿膜作用和抗腫瘤效果，為抗瘤藥物KDR siRNA的研發(fā)和臨床腫瘤治療提供一個(gè)新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

靶向KDR基因的siRNA質(zhì)粒載體(KDR-siRNA)、DH5α菌種、肺癌細(xì)胞株A549為本室保存。各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA電泳膠回收、質(zhì)粒抽提試劑盒購自大連TaKaRa公司;SYBR Green Real-Time PCR試劑盒、PCR試劑盒和大量質(zhì)粒 DNA抽提試劑盒購自Qiagen公司;KDR單克隆抗體和二抗 (羊抗鼠)購自 R＆D公司;DNA序列測(cè)定和引物合成由大連TaKaRa公司完成;RPMI1640培養(yǎng)液和新生小牛血清購自Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 TAT的合成 按照TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)48～60位氨基酸(YGRKKRRQRRR)的序列，人工合成編碼TAT-PTD的2條寡核苷酸鏈。正義鏈將2條寡核苷酸鏈等摩爾混合，在95℃變性10 min后，置于72℃水浴中緩慢退火過夜，得到編碼TAT-PTD的雙鏈DNA。

1.2.2 pGC/TAT-KDR siRNA載體的構(gòu)建及鑒定提取 pGC/KDR siRNA質(zhì)粒 DNA，用 NheⅠ和EcoRⅠ分別對(duì)質(zhì)粒和編碼TAT-PTD的雙鏈DNA進(jìn)行雙酶切并回收酶切產(chǎn)物。用T4 DNA連接酶在16℃條件下連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，接種至含有100 μg/mL Amp的 LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。次日挑選單克隆菌落進(jìn)行菌落PCR，陽性克隆提取質(zhì)粒DNA送檢測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)，與理想序列相同，證實(shí)pGC/TAT-KDR siRNA載體構(gòu)建成功。菌落PCR primer:正義鏈 5'-GCCCCGGTT AATTTGCATAT-3';反 義 鏈 5'-GTA ATACGGTTATCCACGCG-3'。反應(yīng)條件:95℃ 5min預(yù)變性，循環(huán)內(nèi)95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，PCR反應(yīng)30個(gè)循環(huán)后72℃ 10 min，然后4℃保存。

1.2.3 慢病毒載體包裝和病毒滴度測(cè)定 參照文獻(xiàn)［2］方法，將pGC/TAT-KDR siRNA重組質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒室溫下溫育5 min后共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞培養(yǎng)8 h。更換含10%小牛血清的完全培養(yǎng)液并繼續(xù)培養(yǎng)48 h。離心后留取富含慢病毒顆粒細(xì)胞的上清液。病毒滴度用倍比稀釋法檢測(cè)。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞2×105/mL，以2×103個(gè)/孔接種至96孔板，每孔體積200 μL。培養(yǎng)24 h后更換無血清培養(yǎng)液，并分組:①pGC/TAT-KDR siRNA組;②pGC/KDR siRNA組;③未轉(zhuǎn)染組(每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔)。各組中分別加入10 MOI的pGC/TAT-KDR siRNA重組病毒、pGC/KDR siRNA重組病毒和等量PBS，感染2 h后更換含10%新鮮小牛血清的培養(yǎng)液，待用。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)KDR蛋白質(zhì)表達(dá)水平 將轉(zhuǎn)染的3組細(xì)胞去掉培養(yǎng)基，1 mL預(yù)冷PBS洗滌2次，加入全蛋白裂解液后冰上裂解10 min。用細(xì)胞刮刮下全蛋白裂解液，收集于離心管。總蛋白樣品各50 μg和5×SDS上樣緩沖液混勻后，100℃沸水煮5 min。常規(guī)進(jìn)行Western blot分析。一抗稀釋比例為1∶3000，二抗稀釋比例為1∶6000。具體方法詳見文獻(xiàn)［2］。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)KDR mRNA表達(dá)水平 Trizol抽提各組總 RNA，反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。按照試劑說明書配好反應(yīng)體系，上機(jī)進(jìn)行Real Time PCR擴(kuò)增和檢測(cè)。反應(yīng)總體系為20 μL:2×Mix SYBR Green I熒光反應(yīng)液 10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各 0.25 μL、樣品模板 1 μL、滅菌水補(bǔ)足。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min，循環(huán)內(nèi)95℃ 30 s變性，60℃退火35 s，PCR反應(yīng)設(shè)置40個(gè)循環(huán)，并在每個(gè)循環(huán)延伸末端點(diǎn)收集熒光信號(hào)，繪制擴(kuò)增曲線;40個(gè)循環(huán)后設(shè)置(95℃ 15 s，60℃30 s，95℃ 15 s)反應(yīng)步驟，并且對(duì)60～95℃ 升溫整個(gè)過程進(jìn)行全程熒光信號(hào)收集，繪制融解曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)定量曲線進(jìn)行PCR產(chǎn)物的定量分析。以β-actin為內(nèi)參照。引物情況見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 The sequence of PCR primers

1.2.7 MTT比色法測(cè)定重組病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用 每間隔24 h向96孔板中加入5 mg/mL MTT溶液，每孔20 μL，將96孔板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h;吸去上清，每孔加入150 μL DMSO置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量各孔的吸光值(波長(zhǎng)492 nm)。

1.2.8 AnnexinV-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡 用無EDTA的0.25%胰蛋白酶收集上述各組細(xì)胞，離心2000 r/min、5 min，沉淀以無菌PBS沖洗，離心2000 r/min、5 min，重復(fù)2次。沉淀以200 μL binding buffer重懸后加入2 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI。流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，AnnexinV標(biāo)記細(xì)胞和PI標(biāo)記細(xì)胞的發(fā)射波長(zhǎng)分別為525 nm和620 nm)。結(jié)果判定:AnnexinV-FITC標(biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)凋亡的細(xì)胞，PI標(biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)壞死的細(xì)胞，AnnexinV和PI雙標(biāo)記的細(xì)胞計(jì)數(shù)晚期凋亡的細(xì)胞，AnnexinV和PI都無標(biāo)記的細(xì)胞計(jì)數(shù)為活細(xì)胞。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為(AnnexinV-FITC－/PI－);右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為(AnnexinV-FITC+/PI+);右下象限為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)(AnnexinV-FITC+/PI－)。

1.2.9 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將4℃過夜溶解的Matrigel，用無血清Medium按1∶9比例稀釋，每個(gè)Transwell小孔加入50 μL稀釋后的 Matrigel，37℃培養(yǎng)3 h。消化收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，以無血清Medium調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，每個(gè)Transwell小室內(nèi)加入細(xì)胞懸液200 μL，即每個(gè)小室含2×104個(gè)細(xì)胞?？淄饧?0%FBSMedium 500 μL，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng);24 h后，取出Transwell小室，吸出孔內(nèi)的 Matrigel，PBS洗2次。用小棉簽拭去Transwell孔內(nèi)的cell和Matrigel。用甲醇∶冰乙酸=3∶1固定膜上的細(xì)胞。1×PBS洗1次，蘇木素復(fù)染30 min，自來水漂洗。在鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，對(duì)每個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算平均值。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)用χ±S表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行處理，多組間比較采用均值方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 pGCTAT/KDR siRNA載體的構(gòu)建及鑒定

對(duì)pGCTAT/KDR siRNA質(zhì)粒載體和編碼TAT-PTD的雙鏈DNA分別用NheⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，并純化酶切產(chǎn)物。經(jīng)T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞，接種至含有新霉素的LB平板培養(yǎng)過夜。挑選單克隆菌落進(jìn)行菌落PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，各克隆菌落的PCR產(chǎn)物均可見目的基因條帶(圖1)，初步篩選到具有插入片段的克隆。將菌落PCR初步鑒定的陽性克隆送檢測(cè)序并進(jìn)行Blast比對(duì)。測(cè)序結(jié)果顯示pGCTAT/KDR siRNA載體的插入序列與設(shè)計(jì)序列一致，沒有堿基缺失或替換等(結(jié)果未顯示)。提示 pGCTAT/KDR siRNA載體構(gòu)建成功。

圖1 菌落PCR結(jié)果Fig.1 The results of cloning PCR

2.2 慢病毒載體的包裝

將pGCTAT/KDR siRNA重組質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)后離心，留取富含慢病毒顆粒細(xì)胞的上清液。倍比稀釋法測(cè)定病毒滴度為2.9×108Tu/mL，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

2.3 Western blotting檢測(cè) KDR蛋白質(zhì)表達(dá)水平

將收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞以2×103個(gè)/孔接種至96孔板，并分組:①pGC/TAT-KDR siRNA組;②pGC/KDR siRNA組;③未轉(zhuǎn)染組(每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔)。各組中分別加入10 MOI的pGC/TAT-KDR siRNA重組病毒、pGC/KDR siRNA重組病毒和等量PBS進(jìn)行感染并加入全蛋白裂解液后冰上裂解、回收，常規(guī)進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果見圖2。對(duì)照組存在較高水平的KDR蛋白表達(dá)，而 pGC/TAT-KDR siRNA組和 pGC/KDR siRNA組KDR蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯示明顯抑制，有顯著性差異，其中pGC/TAT-KDR siRNA組細(xì)胞的抑制效果最強(qiáng)。

圖2 KDR蛋白質(zhì)表達(dá)水平Fig.2 The expression level of KDR protein by western blotting

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)KDR mRNA表達(dá)水平

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞KDR mRNA表達(dá)水平。由圖3可見，pGC/TAT-KDR siRNA組和pGC/KDR siRNA組與對(duì)照組相比，KDR mRNA表達(dá)水平均有顯著下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且 pGC/TAT-KDR siRNA 組與 pGC/KDR siRNA組相比，KDR mRNA表達(dá)水平下降更顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖3 KDR mRNA表達(dá)水平Fig.3 The expression level of KDR mRNA by Real-time quantitative PCR

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

圖4 AnnexinV-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡Fig.4 The cellular apoptosis detection with Double staining by flow cytometry

將各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞用Annexin-V和PI染色雙染色后，分析細(xì)胞凋亡。由圖4可見，各組的細(xì)胞凋亡率分別為對(duì)照組(3.37±0.12)%、pGC TAT/KDR siRNA 組(49.43 ±1.87)%、pGC KDR siRNA 組(40.82 ±1.36)%。pGC TAT/KDR siRNA組和pGC KDR siRNA組與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡有顯著差異，P＜0.01。pGC TAT/KDR siRNA組的細(xì)胞凋亡率明顯高于pGC KDR siRNA組，P＜0.05。說明 pGC TAT/KDR siRNA 組和pGC KDR siRNA組均有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，其中pGC TAT/KDR siRNA組的作用更強(qiáng)。

2.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

本研究采用Transwell實(shí)驗(yàn)觀察了pGC TAT/KDR siRNA和pGC KDR siRNA慢病毒載體對(duì)A549細(xì)胞組侵襲、轉(zhuǎn)移的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞數(shù)為(202.67±8.50)個(gè)，pGC KDR siRNA 組為(91.33 ±7.64)個(gè)，pGC TAT/KDR siRNA 組為(36.19±5.29)個(gè)。pGC KDR siRNA組和pGC TAT/KDR siRNA組均明顯抑制了A549細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移(P＜0.01)，特別是 pGC KDR siRNA組抑制A549細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于pGC KDR siRNA(P＜0.01)。說明 pGC TAT/KDR siRNA慢病毒載體具有更強(qiáng)的抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的能力(圖5)。

圖5 pGC TAT/KDR siRNA慢病毒載體抑制細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的作用Fig.5 The inhibition of cell invasion and metastasis by PGC TAT/KDR siRNA lentiviral vector

2.7 MTT法檢測(cè)pGC TAT/KDR siRNA慢病毒載體對(duì)細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果顯示，pGC TAT/KDR siRNA和 pGC KDR siRNA在轉(zhuǎn)染 A549細(xì)胞72、96 h后，A549細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制，且pGC TAT/KDR siRNA抑制細(xì)胞增殖的作用更為明顯。說明pGC TAT/KDR siRNA比pGC KDR siRNA有更強(qiáng)的細(xì)胞增殖抑制作用(圖6)。

圖6 pGC TAT/KDR siRNA抑制細(xì)胞增殖的作用Fig.6 The inhibition of cell proliferation by pGC TAT/KDR siRNA lentiviral vector

3 討論

自1997年Vives等［7］首次發(fā)現(xiàn)TAT蛋白是一個(gè)與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能相關(guān)的多肽片段以來，TAT結(jié)構(gòu)、功能的研究取得了突破性進(jìn)展。目前研究表明，TAT蛋白由酸性N-末端區(qū)、半胱氨酸(Cys)富積區(qū)、核心區(qū)、基本區(qū)和C-末端區(qū)5個(gè)區(qū)構(gòu)成。其中基本區(qū)中的47～57位氨基酸的多肽片段富含堿性氨基酸的(YGRKKRRQRRR)是蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的最小單位，稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域，與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能相關(guān)［8］。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)了3個(gè)高效的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域，分別來自HIV-1 Tat、果蠅同源異型轉(zhuǎn)錄因子ANTP和單純皰疹病毒1型(HSV-1)VP22轉(zhuǎn)錄因子［9-11］。

TAT具有不依賴胞吞作用的穿膜效果，將多肽、蛋白質(zhì)分子及DNA片段有效地導(dǎo)入多種腫瘤細(xì)胞和正常的哺乳類動(dòng)物細(xì)胞，具有無受體介導(dǎo)、無耗能和細(xì)胞無損傷的特點(diǎn)［12］，因此作為生物活性分子有效的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)工具，TAT已廣泛應(yīng)用于基因治療、細(xì)胞生物學(xué)、臨床藥效評(píng)價(jià)、藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)以及細(xì)胞免疫學(xué)等研究領(lǐng)域。

KDR是腫瘤生長(zhǎng)、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中起著重要作用的VEGF受體，本課題組在前期研究中成功構(gòu)建了靶向KDR的RNA干擾的質(zhì)粒載體和慢病毒載體系統(tǒng)，有效地抑制了肝癌細(xì)胞和小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞株KDR基因的表達(dá)，遏制了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。但由于質(zhì)粒載體和慢病毒不同程度存在著宿主細(xì)胞感染效率低、難以穿透腫瘤細(xì)胞生物屏障和毒性作用大且易造成細(xì)胞損傷甚至死亡等問題，限制了其在腫瘤治療中的廣泛應(yīng)用［12］。為此，本課題組構(gòu)建了TAT介導(dǎo)的KDR靶向siRNA慢病毒載體，通過將TAT的穿膜作用與KDR siRNA的抗腫瘤作用相結(jié)合，觀察其與無TAT介導(dǎo)的KDR RNAi慢病毒載體系統(tǒng)相比，是否在抑制KDR基因表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抗腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用方面能發(fā)揮更大的生物學(xué)效應(yīng)。

本研究按照TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)48～60位氨基酸(YGRKKRRQRRR)的序列，人工合成編碼TAT-PTD的2條寡核苷酸鏈，將其插入pGC KDR siRNA載體。經(jīng)菌落PCR和測(cè)序證實(shí)pGCTAT/KDR siRNA載體構(gòu)建成功并有效地進(jìn)行慢病毒載體的包裝。Western blotting和Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)顯示，該慢病毒載體與pGC KDR siRNA慢病毒載體相比，有更強(qiáng)的KDR基因表達(dá)抑制作用;雙染色流式細(xì)胞儀分析顯示，pGC TAT/KDR siRNA慢病毒載體與pGC KDR siRNA慢病毒相比具有更強(qiáng)的細(xì)胞凋亡促進(jìn)作用;Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，pGC TAT/KDR siRNA慢病毒載體也具有比pGC KDR siRNA慢病毒更強(qiáng)的抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的能力;MTT法也證實(shí)pGC TAT/KDR siRNA慢病毒載體比pGC KDR siRNA慢病毒載體具有更強(qiáng)的細(xì)胞增殖抑制作用。說明TAT介導(dǎo)的KDR-siRNA慢病毒載體具有高效、快速的抗腫瘤作用，為KDR-siRNA和TAT在腫瘤治療臨床應(yīng)用中奠定了一定的實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

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