田迪，秦亞飛，應如，譚迎，馮力，袁勇，賴文巖，郭志剛

動脈粥樣硬化性疾病是目前全球死亡的主要原因之一。目前認為氧化應激和炎癥在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用[1]，抗炎抗氧化在抗動脈粥樣硬化過程中具有重要意義。研究已證實高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)除具有促膽固醇逆轉運作用外，還有抗炎抗氧化的功能[2]，改善HDL抗炎抗氧化功能可延緩動脈粥樣硬化進展。血清屏氧酶1(paraoxonase 1，PON1)活性、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性和HDL炎癥指數(shù)(highdensity lipoprotein inflammatory index，HII)這3個指標可準確反映HDL的抗炎抗氧化功能[2]，國外研究曾報道冠心病患者血清PON1活性明顯下降[3]，HII明顯升高[4]，而關于反映載脂蛋白A-I(apoA-I)損傷程度的血清MPO活性及聯(lián)合檢測上述3個指標的研究目前國內外尚未見報道。

辛伐他汀作為目前臨床常用的他汀類調脂藥物之一，具有減輕動脈粥樣硬化[5]、穩(wěn)定斑塊、減少心血管事件[6]、抑制心肌梗死后心室重構[7]的作用。研究已證實其抗動脈粥樣硬化的主要機制在于降低低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoproteincholesterol，LDL-C)水平，而且具有輕度升高高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)的作用[8]，但其是否對HDL的抗炎抗氧化功能具有影響目前國內鮮見報道。本實驗采用apoE－/－小鼠動脈粥樣硬化小鼠模型，檢測其血清PON1活性、MPO活性、HII以及其他相關指標，研究辛伐他汀對HDL抗炎抗氧化功能的影響，以進一步探討辛伐他汀抗動脈粥樣硬化的作用機制。

圖1 動物干預流程圖Fig. 1 Flow chart of experimental protocol of interventions

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡健康雄性apoE－/－小鼠購自北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部，同齡健康雄性C57BL/6J小鼠購自南方醫(yī)科大學動物實驗中心，普通飼料和高脂飼料(含21%豬油、0.15%膽固醇)[9]均購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。辛伐他汀購自杭州默沙東制藥有限公司，乙酸苯酯購自美國Sigma公司，血清MPO活性測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，小鼠高敏C反應蛋白(high sensitive C reactive protein，hs-CRP)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司(Cusabio)。AU-5421型生化自動分析儀、BX51型電子顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)購自日本Olympus公司，Universal 16R型低溫冷凍高速離心機購自美國Hettich公司，ND-1000 Spectrophotometer型分光光度儀購自美國NanoDrop公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及干預 18只8周齡C57BL/6J小鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，作為對照組，30只8周齡apoE－/－小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)4周后隨機乙醚麻醉處死兩組小鼠各6只，檢測相應指標作為研究基線(第4周)。其余24只apoE－/－小鼠隨機分為動脈粥樣硬化組(AS組，n=12)和辛伐他汀組(n=12)，剩下的12只C57BL/6J小鼠仍作為對照組。對照組和AS組小鼠繼續(xù)原飼料喂養(yǎng)，辛伐他汀組在高脂飼料喂養(yǎng)基礎上給予辛伐他汀5mg/(kg·d)灌服，對照組和AS組小鼠給予等體積生理鹽水灌服，第8、16周后，分別處死3組小鼠(每組每個時間點6只)并測定相應指標。動物干預流程如圖1所示。

1.2.2 血脂測定 實驗第4、8、16周末，在空腹12h狀態(tài)下麻醉小鼠后心臟采血，3000r/min離心10min，留取血清，－80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用酶法在日本日?6002020全自動生化儀上測定血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、LDL-C、HDL-C、甘油三酯(triglyceride，TG)含量。

1.2.3 血清PON1活性測定 采用Rozenberg等[10]的分光光度法測定血清PON1活性：取反應緩沖液(CaCl22mmol/L，Tris-HCl 0.1mol/L，pH8.0)1.3ml，加入5mmol/L乙酸苯酯150μl，于25℃預溫20min后，加入1:10倍稀釋的樣本血清50μl(稀釋液為反應緩沖液)，反應90s，用0.5mol/L EDTA 100μl終止反應。然后用分光光度計于270nm波長處測定吸光度(A)值。同時設立血清對照和底物對照。酶活性計算公式：PON1活性=A×f×FV×103/(t×SV×L×ε)。A為凈吸光度值(即標本A值－血清對照和底物對照的A值)，f為標本稀釋倍數(shù)，F(xiàn)V為反應終體積，t為反應時間，SV為樣品體積，L為光徑，ε為摩爾消光系數(shù)，270nm波長處乙酸苯酯的ε=1310L/(mol·cm)。酶的活性單位(U)定義為每分鐘催化1μmol乙酸苯酯水解所需的酶量。

1.2.4 血清MPO活性測定 血清MPO活性根據(jù)南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書進行測定。酶活力單位定義：每升血清在37℃反應體系中分解1μmol H2O2為1個酶活力單位。計算公式：MPO(U/L)=(測定管A值－對照管A值)/[11.3×取樣量(L)]。

1.2.5 血清hs-CRP含量測定 小鼠血清hs-CRP含量采用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)檢測，具體操作嚴格根據(jù)武漢華美生物工程有限公司(Cusabio)提供的小鼠試劑盒說明書進行。

1.2.6 血清HII測定 血清HII采用非細胞學法[4]測定：10μl葡聚糖硫酸酯與100μl血清混合后8000×g離心10min，上清僅含HDL-C(無LDL-C和VLDLC)，用膽固醇試劑盒測定上清膽固醇量，調整膽固醇終濃度為10μg/ml；將2,7-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)溶于新鮮甲醇(終濃度2mg/ml)，室溫下避光孵育30min，制成2,7-二氫二氯熒光黃(DCFH)溶液；將1-棕櫚酰-2-(5,6-環(huán)氧異前列腺素E2)錫甘油-3-磷酸膽堿溶液(PEIPC，終濃度為50μg/ml)10μl和含HDL的上清液90μl在黑聚苯乙烯微盤中混合，并放入37℃烤箱中孵育1h；再在微盤的每個孔中加入10μl DCFH溶液(0.2mg/ml)混合，放入37℃烤箱中孵育2h；用熒光分析儀分析熒光強度(激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為530nm，終止波長為515nm)，如數(shù)值小于1，則判斷HDL顆粒有抗炎作用，如數(shù)值大于1，則判斷為有促炎作用(HDL缺乏時，將PEIPC氧化DCFH所形成的熒光強度標準化為數(shù)值1)。

1.2.7 主動脈斑塊面積測量 心臟采血后，在大體顯微鏡下從升主動脈起始部至髂動脈分叉處分離小鼠主動脈，然后縱行剖開主動脈，采用油紅O染色主動脈內膜斑塊，拍照后應用Image-plus 6.0圖像分析軟件分析主動脈斑塊/血管內膜表面積比例。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有計量資料均以x±s表示，并采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行兩樣本均數(shù)比較的獨立樣本t檢驗，多組間總體均數(shù)比較在方差齊時采用單因素方差分析，方差不齊時采用Welch校正檢驗，多個樣本均數(shù)間的多重比較方差齊時采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Dunnett's T3檢驗，相關性分析采用Spearman相關分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 3組小鼠血脂水平的變化 對照組第4、8、16周TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較無明顯變化；與4周比較，AS組小鼠給予高脂飼料8、16周后TC、TG、LDL-C水平均明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。AS組各時間點TC、TG、LDL-C水平與同時間點對照組比較均明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。第8周時，辛伐他汀組TC、TG水平與AS組比較明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)，而LDL-C、HDL-C無明顯變化。第16周時，辛伐他汀組TC、TG、LDL-C水平與AS組比較均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，但仍高于對照組(P＜0.01)，而HDL-C水平與AS組比較明顯升高(P＜0.05，表1)。

2.2 辛伐他汀對apoE－/－小鼠血清PON1活性、MPO活性、HII及hs-CRP含量的影響 與第4、8周時比較，第16周時對照組小鼠血清PON1活性明顯降低(P＜0.01)，MPO活性無明顯變化，HII、hs-CRP含量明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。隨時間進展，AS組小鼠PON1活性逐漸降低，MPO活性、hs-CRP含量和HII均逐漸升高。AS組小鼠血清PON1活性在4周時與對照組比較無明顯差異，8、16周時則明顯低于對照組(P＜0.01)；MPO活性、hs-CRP、HII水平在4周時與對照組比較無明顯差異，8、16周時均明顯高于對照組(P＜0.01)。第8、16周時辛伐他汀組小鼠血清PON1活性均高于AS組(P＜0.01)，但低于對照組(P＜0.01)；hs-CRP含量均低于AS組，8周時與對照組比較無明顯差異，而16周時高于對照組(P＜0.01)；MPO活性和HII均低于AS組，但高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01，表2)。

2.3 主動脈斑塊/血管內膜表面積比值 油紅O染色后拍照并分析主動脈弓至胸主動脈斑塊/血管內膜表面積比值，結果顯示AS組主動脈斑塊/血管內膜表面積比值隨時間進展逐漸增加，且明顯高于同期對照組(4周：9.90%±1.90% vs 2.24%±0.47%，P＜0.01；8周：33.23%±7.12% vs 2.45%±0.36%，P＜0.01；16周：44.30%±11.85% vs 2.54%±0.25%，P＜0.01)；辛伐他汀組16周時主動脈斑塊/血管內膜表面積比值(19.77%±1.95%)與8周時(13.79%±2.01%)比較明顯增加(P＜0.01)，但均低于同時間點AS組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖2)。

表1 實驗第4、8、16周各組小鼠血脂水平比較(mmol/L，±s，n=6)Tab.1 Comparison on serum lipid levels among the three groups at 4, 8, 16 weeks (mmol/L,±s, n=6)

表1 實驗第4、8、16周各組小鼠血脂水平比較(mmol/L，±s，n=6)Tab.1 Comparison on serum lipid levels among the three groups at 4, 8, 16 weeks (mmol/L,±s, n=6)

(1)P＜0.01, (2)P＜0.05 compared with control group; (3)P＜0.01, (4)P＜0.05 compared with AS group; (5)P＜0.01, (6)P＜0.05 compared with 4 weeks; (7)P＜0.01, (8)P＜0.05 compared with 8 weeks

Time point TC TG LDL-C HDL-C 4 weeks Control 3.27±0.27 0.71±0.17 0.44±0.10 2.41±0.38 AS 14.64±1.16(1) 1.84±0.27(1) 8.10±0.95(1) 2.96±0.46(2)8 weeks Control 3.52±0.41 0.79±0.14 0.53±0.11 2.46±0.21 AS 16.40±2.04(1) 2.31±0.34(1)(6) 9.32±1.18(1) 2.62±0.32 Simvastatin 11.78±1.57(1)(3) 1.96±0.12(1)(4) 8.13±1.81(1) 2.90±0.37(2)16 weeks Control 3.17±0.53 0.91±0.32 0.55±0.10 2.27±0.32 AS 22.42±1.99(1)(5)(7) 2.68±0.28(1)(5)(8) 12.45±1.29(1)(5)(7) 1.60±0.22(1)(5)(7)Simvastatin 14.89±2.06(1)(3)(8) 2.34±0.17(1)(4)(7) 7.59±1.25(1)(3) 2.03±0.40(4)(7)

表2 各組小鼠血清PON1活性、MPO活性、HII、hs-CRP水平(s, n=6)Tab. 2 Serum PON1 and MPO activity, HII and hs-CRP levels of the three groups ±s, n=6)

表2 各組小鼠血清PON1活性、MPO活性、HII、hs-CRP水平(s, n=6)Tab. 2 Serum PON1 and MPO activity, HII and hs-CRP levels of the three groups ±s, n=6)

(1)P＜0.01, (2)P＜0.05 compared with control group; (3)P＜0.01, (4)P＜0.05 compared with AS group; (5)P＜0.01, (6)P＜0.05 compared with 4 weeks; (7)P＜0.01, (8)P＜0.05 compared with 8 weeks

Time point PON1 (U/ml) MPO (U/L) HII hs-CRP (ng/ml)4 weeks Control 126.32±7.52 27.52±3.00 0.58±0.12 96.30±20.32 AS 121.13±9.50 31.14±3.21 0.72±0.11 116.76±16.15 8 weeks Control 124.89±6.98 29.84±2.92 0.61±0.07 110.06±14.39 AS 100.11±7.72(1)(5) 50.47±3.12(1)(5) 0.99±0.11(1)(5) 141.39±10.25(1)(5)Simvastatin 116.18±6.74(3) 39.07±3.17(1)(3) 0.81±0.09(1)(3) 118.79±15.98(4)16 weeks Control 103.66±10.26(5)(7) 30.84±3.12 0.79±0.09(5)(7) 132.19±15.35(5)(8)AS 48.03±6.47(1)(5)(7) 56.30±3.77(1)(5)(7) 1.33±0.11(1)(5)(7) 236.09±18.87(1)(5)(7)Simvastatin 63.39±5.96(1)(3)(7) 43.20±6.66(2)(3) 0.96±0.09(1)(3)(8) 193.59±27.58(1)(3)(7)

圖2 實驗16周后3組小鼠主動脈斑塊面積(油紅O染色)Fig. 2 The percentage plaque area of the three groups at 16 weeks (oil red O staining)A. Control group; B. AS group; C. Simvastatin group

2.4 相關性分析 將血清PON1活性、MPO活性、HII、hs-CRP含量與主動脈斑塊/血管內膜表面積比值進行相關性分析，結果顯示小鼠血清PON1活性與主動脈斑塊/血管內膜表面積比值呈顯著負相關(r=－0.679，P＜0.01)，MPO活性、HII、hs-CRP與主動脈斑塊/血管內膜表面積比值均呈顯著正相關(r值分別為0.893、0.813、0.701，P＜0.01)。

3 討 論

本研究中，高脂飼養(yǎng)組的apoE－/－小鼠血脂水平明顯升高，主動脈油紅O染色可見明顯斑塊形成，提示動脈粥樣硬化小鼠模型造模成功。

辛伐他汀是一種3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶抑制劑，目前已明確其具有降低LDL-C及輕度升高HDL-C的作用[8]。本研究中與動脈粥樣硬化組比較，經(jīng)辛伐他汀干預后小鼠血清TC、LDL-C水平均明顯降低，同時血清HDL-C水平升高，與相關研究結果一致[11]。

PON1活性、MPO活性、HII均為準確反映HDL抗炎抗氧化功能的特異性指標，雖然國外學者曾報道冠心病患者血清PON1活性明顯下降[3]，HII明顯升高[4]，但反映apoA-I損傷程度的血清MPO活性目前國內外鮮有研究。本研究在動物實驗中聯(lián)合檢測上述3個指標，可準確反映HDL的抗炎抗氧化功能以及辛伐他汀對HDL抗炎抗氧化功能的影響。

PON1是HDL重要的抗氧化酶之一，與HDL的抗氧化、抗動脈粥樣硬化作用密切相關。由于PON1必須與apoA-I結合才能發(fā)揮抗氧化功能，所以PON1的血清濃度不能完全反映HDL抗氧化功能的強弱，而其活性才能更好地反映HDL的抗氧化功能[12]。Graner等[13]研究發(fā)現(xiàn)冠心病組PON1活性及濃度明顯高于正常對照組，且其活性及濃度與冠脈病變嚴重程度相關。本研究也發(fā)現(xiàn)AS組血清PON1活性較對照組明顯下降，而辛伐他汀干預后apoE－/－小鼠血清PON1活性較AS組明顯升高，提示辛伐他汀可能有助于升高血清PON1活性，從而改善HDL的抗氧化功能。

MPO是一種由中性粒細胞、單核巨噬細胞等產(chǎn)生的強致氧化性酶，可氧化修飾血液循環(huán)和組織中的apoA-I，其色氨酸、酪氨酸、賴氨酸和甲硫氨酸殘基被氧化修飾后可發(fā)生結構改變，從而影響其與ATP結合盒轉運子A1(ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)的結合，進而影響HDL經(jīng)ABCA1途徑的促膽固醇逆轉運及抗炎抗氧化功能[14]。本研究中AS組血清MPO氧化活性較對照組顯著升高，提示其HDL的正常功能受到損害，而辛伐他汀組血清MPO活性較AS組明顯降低，表明辛伐他汀可降低血清MPO活性，改善HDL的抗炎抗氧化功能。

AS是以血管壁慢性炎癥為特征的病理過程。正常情況下HDL可促進膽固醇逆轉運，抑制LDL的氧化修飾，減少炎癥因子產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎功能，而在AS狀態(tài)下，HDL并沒有抗AS作用，甚至還可促進血管壁的炎癥反應。有研究表明冠心病患者HDL炎癥指數(shù)明顯高于正常對照組，HDL功能處于致炎狀態(tài)[4]。Navab等[15]研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者接受辛伐他汀(40mg/d)治療6周后HII即明顯下降。本研究也得到了相似的結果，再次證明辛伐他汀可降低HII，促使HDL由致炎狀態(tài)向抗炎狀態(tài)轉變。

C反應蛋白(CRP)是目前研究最多的AS相關炎性生物標志物，盡管CRP是一種急性期反應產(chǎn)物，由肝細胞在感染、損傷等應激條件下受IL-6誘導合成，但參與了AS形成的全過程，其血漿水平升高高度提示存在AS風險。流行病學資料表明血清或血漿中CRP水平升高與AS密切相關，是AS的獨立預測因素[16]。在本研究中，AS組血清hs-CRP水平較對照組明顯升高，而辛伐他汀治療后其血清水平顯著下降，與主動脈斑塊/血管內膜表面積比值這一AS金標準的測定結果一致，進一步表明辛伐他汀可抑制炎癥反應，進而發(fā)揮抗AS作用。

綜上所述，辛伐他汀除降低LDL-C、升高HDL-C水平外，還可通過升高PON1活性、降低MPO活性、降低HII、抑制炎癥反應等途徑改善HDL的抗炎抗氧化功能，從而減少主動脈內膜斑塊面積，發(fā)揮抗AS作用。本研究結果提示辛伐他汀不僅是一種降低LDL-C、升高HDL-C水平的調脂藥物，而且具有改善HDL功能的作用，后者也應該受到我們的重視。

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