蘇紅，周波，段雅倩，杜超

所謂“代謝記憶”現(xiàn)象是指高糖介導的微血管病變即使在后續(xù)血糖控制達標后仍可持續(xù)進展[1-2]。體內(nèi)外研究已證實氧化應激、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)形成、蛋白激酶C(PKC)β2的激活等生化異常和表觀遺傳修飾與代謝記憶的啟動和維持關系密切[3]，但大量隨機對照試驗卻表明針對上述單一“經(jīng)典”的生化機制進行干預后結(jié)果并不理想[4]，因此探尋微血管固有細胞中上述機制的匯聚點正成為學界的關注熱點。本小組及Kaur等[5]均發(fā)現(xiàn)高糖應激可誘導轉(zhuǎn)錄共激活子p300激活，且p300可發(fā)揮組蛋白乙酰化修飾作用，從而使轉(zhuǎn)錄因子介導的效應基因表達在血糖正常后仍持續(xù)開放。目前，尚不清楚p300是否為代謝記憶各種刺激共同的信號“記憶”分子。為此，本研究以人系膜細胞(HMCs)作為體外模擬高糖記憶的研究對象，觀察p300及組蛋白乙酰化、PKCβ2和活性氧(ROS)的表達規(guī)律，并探討p300和組蛋白乙?；鞍譎3(Ac-H3)、Ac-H4在其中可能的潛在作用，為整合代謝記憶機制及防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑 HMCs由重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學研究所惠贈。PKCβ2重組腺病毒載體(Ad5-PKCβ2)、重組腺病毒空載體(Ad5-null)的合成及鑒定已由本課題組完成[6]。DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；新生牛血清購自杭州四季青公司；牛血清白蛋白和CGP53353購自Sigma公司；D-葡萄糖購自加拿大Bio Basic公司；兔抗PKCβ2、兔抗p300及兔抗Ac-Histone H4多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；兔抗Ac-Histone H3多克隆抗體購自Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG購自北京博奧森公司；活性氧檢測試劑盒和β-actin小鼠單克隆抗體購自江蘇碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HMCs用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃，飽和濕度5%CO2的培養(yǎng)箱中。隔日換液，實驗前給予無血清DMEM培養(yǎng)液孵育細胞24h使其生長同步化，根據(jù)后續(xù)實驗設計分組培養(yǎng)細胞。

1.2.2 AGEs-BSA的制備 參照Valencia等[7]的方法并進行改良。在1mol/L、pH為7.4的PBS溶液中加入一定量的葡萄糖使其終濃度為500mmol/L，待充分溶解后，加入牛血清白蛋白(BSA)溶液，使其終濃度為50mg/ml。采用0.22μm的針頭濾器過濾除菌，避光于37℃孵箱孵育90d。以不含葡萄糖的BSA溶液按上述方法配置作為對照。經(jīng)孵育的血清用PBS充分透析除去未結(jié)合的葡萄糖，過濾除菌，分裝封口后冷凍保存?zhèn)溆?。取少量樣品采用熒光分光光度儀(激發(fā)波長380nm，發(fā)射波長450nm)進行光譜掃描及濃度測定。結(jié)果以任意熒光單位(AFU)表示。

1.2.3 實驗分組 根據(jù)預實驗結(jié)果，分別用H2O2(100μmol/L，30min)和AGEs(250μg/ml，48h)干預HMCs，并選擇感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=10進行Ad5-PKCβ2及Ad5-null的轉(zhuǎn)染。

1.2.3.1 高糖誘導代謝記憶模型 模擬高糖誘導代謝記憶，觀察高糖誘導HMCs對p300及組蛋白乙?；磉_是否有記憶效應，同時是否伴有氧化應激和PKCβ2的持續(xù)激活。實驗分為：正糖組(NG，5.5mmol/L D-葡萄糖×2d)；滲透壓組(LG，NG+20mmol/L L-葡萄糖×2d)；高糖組(HG，25mmol/L D-葡萄糖×2d)；記憶組(M1、M2、M3，25mmol/L D-葡萄糖×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3、6、9d)；持續(xù)正糖組(5.5mmol/L D-葡萄糖×9d)。

1.2.3.2 糖基化終末產(chǎn)物記憶模型 模擬糖基化終末產(chǎn)物記憶，分為正糖組(NG，5.5mmol/L D-葡萄糖×2d)；正糖+AGEs組(AGEs，5.5mmol/L D-葡萄糖+250μg/ml AGEs×2d)；AGEs記憶組(AGEs-M，5.5mmol/L D-葡萄糖+250μg/ml AGEs×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d)；BSA組(NG+BSA，給予同濃度BSA對照)。

1.2.3.3 H2O2模擬氧化應激記憶模型 體外用H2O2模擬氧化應激記憶，分為正糖組(NG，5.5mmol/L D-葡萄糖×30min)；正糖+H2O2組(H2O2，5.5mmol/L D-葡萄糖+100μmol/L H2O2×30min)；H2O2記憶組(H2O2-M，5.5mmol/L D-葡萄糖+100μmol/L H2O2×30min+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d)；正糖對照組(NG3，5.5mmol/L D-葡萄糖×3d)。

1.2.3.4 PKCβ2激活記憶模型 體外轉(zhuǎn)染PKCβ2過表達載體模擬PKCβ2激活記憶，分為正糖組(NG，5.5mmol/L D-葡萄糖×2d)；高糖組(HG，25mmol/L D-葡萄糖×2d)；記憶組(M，25mmol/L D-葡萄糖×2d +5.5mmol/L D-葡萄糖×3d)；空載體記憶組(HN，25mmol/L D-葡萄糖+Ad5-null×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d)；PKCβ2激活記憶組(PO，25mmol/L D-葡萄糖+Ad5-PKCβ2×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d)；PKCβ2抑制劑記憶組(PI，25mmol/L D-葡萄糖×2d+10μmol/L CGP53353+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d)。

1.2.4 細胞內(nèi)ROS檢測 不帶熒光的二氫二氯熒光素(DCFDA)可自由穿透細胞膜進入細胞，在細胞內(nèi)可被ROS氧化生成熒光物質(zhì)DCF，其熒光強度可反映細胞內(nèi)ROS含量。細胞經(jīng)上述分組培養(yǎng)于6孔板后，按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，終濃度為10μmol/L。吸棄板內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入1ml 10μmol/L DCFH-DA，37℃避光孵育45min，采用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞3次，用倒置熒光顯微鏡及熒光酶標儀(激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長530nm)檢測各組細胞內(nèi)熒光強度。

1.2.5 Western blotting檢測蛋白表達 參照文獻[5]方法并加以改良，根據(jù)預先分組處理收集細胞，提取總蛋白并定量。分別經(jīng)6%(p300)、10%(PKCβ2)和15%(Ac-H3、Ac-H4)SDS-PAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜；分別加入兔抗p300多克隆抗體(1:500)、兔抗PKCβ2多克隆抗體(1:500)、兔抗Ac-H3多克隆抗體(1:3000)、兔抗Ac-H4多克隆抗體(1:500)和β-actin抗體(1:1000)，于4℃過夜；TBST洗膜后再分別加入HRP標記的山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG(1:2500稀釋)，37℃孵育1h；采用ECL試劑化學發(fā)光顯色，用Quantity One分析軟件系統(tǒng)測定蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理 各實驗獨立重復3次。應用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以x±s表示。采用單因素方差分析(ANOVA)進行多組均數(shù)間計量資料的比較，組內(nèi)兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 高糖記憶對HMCs表達ROS水平的影響與NG組相比，LG組和NC組ROS熒光強度無統(tǒng)計學差異。HG組ROS熒光強度較NG組增加了87%(P＜0.05)，而高糖培養(yǎng)后再正糖培養(yǎng)3、6、9d，ROS熒光強度仍較NG組分別增加了79%、63%和48%(P＜0.05，圖1)。該結(jié)果表明，高糖可增加HMCs ROS表達，當糖濃度恢復正常后ROS仍持續(xù)激活，且至少可以存在9d。

2.2 高糖記憶對HMCs p300、Ac-H3、Ac-H4和PKCβ2蛋白水平表達的影響 與NG組相比，HG組p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表達均顯著上調(diào)，分別增加了115%、93%和87%(P＜0.05)；而LG組與NG組相比，各蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，說明高糖可上調(diào)p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表達，該效應與滲透壓無關。高糖培養(yǎng)2d后再繼續(xù)正糖培養(yǎng)3、6、9d，p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白的表達仍較NG組顯著升高(P＜0.05)，其中M3組較NG組上述蛋白表達分別增加了75%、49%和47%(P＜0.05)。同樣，高糖可誘導HMCs PKCβ2蛋白顯著上調(diào)，與NG組比較增加了130%，而M1、M2和M3組PKCβ2蛋白表達較NG組表達仍增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖2)。以上結(jié)果提示，高糖誘導的HMCs p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表達增高在糖濃度恢復正常后持續(xù)存在，且同時伴PKCβ2表達的持續(xù)激活。

2.3 AGEs誘導糖基化終產(chǎn)物記憶模型下HMCs p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表達 基于上述高糖記憶時間，選取AGEs干預后再正糖培養(yǎng)3d模擬糖化終產(chǎn)物記憶。Western blotting檢測結(jié)果顯示，在生理糖濃度(5.5mmol/L)時，BSA并不增加HMCs p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白的表達，而AGEs組p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表達水平均顯著升高，較對照組分別升高了1.73倍、1.08倍和1.05倍(P＜0.05)。AGEs-M組p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表達較對照組分別升高了1.47倍、0.95倍和1.03倍(P＜0.05，圖3)。該結(jié)果提示，AGEs誘導HMCs p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表達上調(diào)，且當除去AGEs后繼續(xù)正糖培養(yǎng)3d，p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表達差異仍有統(tǒng)計學意義，存在記憶效應。

圖1 各組人腎小球系膜細胞ROS水平變化(熒光顯微鏡 ×200)Fig. 1 Changes of intracellular reactive oxygen levels in each group of HMCs (Fluorescence microscope ×200)A. Normal glucose group; B. Osmotic control group; C. High glucose group; D. High glucose (2d)+normal glucose (3d) group; E. High glucose(2d)+normal glucose (6d) group; F. High glucose (2d)+normal glucose (9d) group; G. Continue normal glucose (9d) group

圖2 高糖誘導各組系膜細胞p300、Ac-H3、Ac-H4蛋白和PKCβ2蛋白表達的Western blotting檢測Fig. 2 Expression of p300, Ac-H3, Ac-H4 and PKCβ2 protein induced by high glucose in each group of HMCs (Western blotting)NG. Normal glucose group; LG. Osmotic control group; HG.High glucose group; M1. high glucose (2d)+normal glucose (3d)group; M2. High glucose (2d)+normal glucose (6d) group; M3. High glucose (2d)+normal glucose (9d) group; NC. Continue normal glucose (9d) group

圖3 AGEs干預系膜細胞各組p300、Ac-H3、Ac-H4蛋白表達水平的Western blotting檢測Fig. 3 Expression of p300, Ac-H3 and Ac-H4 protein induced by AGEs in each group of HMCs (Western blotting)NG. Normal glucose group; AGEs. Normal glucose+AGEs group;AGEs-M. Normal glucose+AGEs followed by normal glucose for 3d group; BSA. Normal glucose +BSA group

2.4 H2O2誘導氧化應激記憶模型下HMCs p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白的表達 Western blotting顯示，H2O2干預系膜細胞后p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表達水平均升高，較對照組分別升高了103%、85%和79%(P＜0.05，圖4)，而H2O2-M組p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表達與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，表明單純H2O2誘導氧化記憶模型下p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表達記憶效應不明顯。

2.5 PKCβ2激活記憶模型下HMCs p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表達 采用增強和抑制雙重策略，如圖5所示，與M組相比，HN組p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義；PO組p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表達較M組進一步上調(diào)，伴有PKCβ2蛋白表達增加，分別為M組的1.25倍、1.06倍、1.10倍和1.17倍(P＜0.05)；而PKCβ2抑制劑則可下調(diào)上述蛋白表達(P＜0.05)。提示PKCβ2激活介導高糖所致HMCs p300、Ac-H3和Ac-H4的記憶效應。

圖4 H2O2干預系膜細胞各組p300、Ac-H3、Ac-H4蛋白表達水平的Western blotting檢測Fig. 4 Expression of Ac-H3, Ac-H4 and p300 proteins in each group of HMCs after exposure to hydrogen peroxide (Western blotting)NG. Normal glucose group; H2O2. Normal glucose+H2O2 group;H2O2-M. Normal glucose+H2O2 followed by normal glucose for 3d group; NG3. Normal glucose control group

圖5 PKCβ2激活對系膜細胞各組p300、Ac-H3、Ac-H4蛋白表達水平的影響(Western blotting)Fig. 5 Infl uence of PKCβ2 activation on the expression of Ac-H3,Ac-H4 and p300 protein in each group of HMCs (Western bloは ing)NG. Normal glucose group; HG. High glucose group; M. Memory group; HN. High glucose+empty vector memory group; PO. High glucose+PKCβ2 memory group; PI. High glucose+ PKCβ2 inhibitor CGP53353 memory group

3 討 論

自2008年EI-Osta等[8]首次發(fā)現(xiàn)短暫高糖即可使核因子-κB亞基p65啟動子區(qū)組蛋白甲基化重塑以來，表觀遺傳學修飾與代謝記憶的關系開始受到重視。與組蛋白甲基化既可開放亦可關閉基因表達的作用不同，組蛋白乙?；Ｒ蛑泻碗姾珊驮鰪娛杷宰饔?，使轉(zhuǎn)錄因子更易與DNA結(jié)合，引起RNA聚合酶順利通過核小體陣列，導致轉(zhuǎn)錄事件的發(fā)生[9]。本研究結(jié)果顯示，高糖負荷HMCs可顯著上調(diào)Ac-H3和Ac-H4蛋白表達，國外學者采用染色質(zhì)共沉淀-測序技術分析了高糖負荷血管細胞表觀修飾模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組蛋白H3K9、H3K14呈高度乙?；⑴c了內(nèi)皮功能異常的發(fā)生[10]。他們同時還發(fā)現(xiàn)預先高糖培養(yǎng)HMCs 2d再恢復正糖培養(yǎng)3、6、9d，Ac-H3和Ac-H4蛋白水平仍較正糖組顯著上調(diào)，與Zhong等[11]在細胞和糖尿病大鼠記憶模型中的研究結(jié)果相似。以上結(jié)果表明高糖可誘導靶細胞染色質(zhì)組蛋白乙酰化重塑，且該效應在血糖恢復正常后仍持續(xù)存在。

研究表明，代謝記憶的分子本質(zhì)是糖尿病誘導的關鍵靶細胞中特定轉(zhuǎn)錄復合器在血糖正常后持續(xù)啟動，介導后續(xù)核內(nèi)基因表達譜異常[8]。已證實基因轉(zhuǎn)錄不僅受到眾多轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄共激活子的調(diào)控，還受到表觀遺傳調(diào)控，而后者可作為一種標記或語言，隨細胞分裂而持續(xù)傳遞，其中兼有多功能轉(zhuǎn)錄共激活子和組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HAT)活性的p300在代謝記憶中的變化規(guī)律備受關注。本研究結(jié)果顯示，高糖負荷HMCs可顯著上調(diào)p300表達伴Ac-H3、Ac-H4蛋白表達增加。Yun等[12]在高糖培養(yǎng)的單核細胞模型中，亦發(fā)現(xiàn)p300蛋白表達上調(diào)和HAT活性增強。本研究還發(fā)現(xiàn)，當高糖培養(yǎng)2d恢復正糖培養(yǎng)后，p300蛋白表達仍較正糖組顯著增高，且至少可持續(xù)9d。p300包含多個保守結(jié)構域[13]，不僅可提供多蛋白復合物裝配的支架，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子和基本轉(zhuǎn)錄復合物的橋梁作用，而且p300具有HAT活性，可催化乙酰輔酶A中的乙?；D(zhuǎn)移到組蛋白N-端賴氨酸殘基上，通過表觀修飾導致核因子-κB(NF-κB)、活化蛋白-1(AP-1)、環(huán)磷酸腺苷反應元件結(jié)合蛋白(CREB)等轉(zhuǎn)錄因子活性增加，從而誘導代謝記憶表型形成[8]。

高糖介導的微血管病變“記憶”效應的發(fā)生是多物質(zhì)參與、多因素、多環(huán)節(jié)的復雜病理生理過程[14]。本研究發(fā)現(xiàn)HMCs于高糖作用后ROS水平顯著升高，同時伴有PKCβ2的激活，當恢復正糖培養(yǎng)3、6、9d后，ROS水平及PKCβ2蛋白表達較正糖組仍顯著上調(diào)，此結(jié)果與本小組的前期研究[15]及Roy等[16]的研究結(jié)果類似。有趣的是，雖然高糖可引起ROS增加伴隨p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表達上調(diào)，但是本研究采用H2O2模擬氧化應激記憶，H2O2干預后去除刺激因素再正糖培養(yǎng)3d，原先上調(diào)的p300、Ac-H3及Ac-H4蛋白水平則顯著下降，說明單純的氧化應激并不介導高糖引起的HMCs p300及組蛋白乙酰化記憶效應。國外學者Ceriello等[17]認為ROS是病理生理狀態(tài)下生化反應的瞬時代謝產(chǎn)物，可被機體正?？寡趸烙到y(tǒng)清除，在控制血糖至正常后不易在機體內(nèi)長期蓄積，難以解釋糖尿病患者持續(xù)十幾年或更長時間的代謝記憶，與本研究結(jié)論一致。但去除高糖后，高糖引起ROS增加伴隨p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表達上調(diào)持續(xù)存在的機制尚未明了。我們認為此可能與高糖誘發(fā)氧化應激，加重了PKCβ2激活，形成惡性循環(huán)有關。本實驗通過重組腺病毒Ad5-PKCβ2過表達模擬PKCβ2激活記憶現(xiàn)象，結(jié)果顯示PKCβ2激活可進一步上調(diào)p300及乙?；M蛋白的表達，且該效應在正糖培養(yǎng)后仍持續(xù)存在，而給予PKCβ2選擇性抑制劑CGP53353處理則可使上述蛋白的表達水平明顯下調(diào)。同時本小組既往研究已證實，給予抗氧化劑可下調(diào)正糖培養(yǎng)后原本由高糖誘導的PKCβ2持續(xù)激活，進一步支持氧化應激-PKCβ2在高糖誘導的p300及組蛋白乙?；厮苡洃浶械闹匾饔肹15]。有研究表明，高糖誘導的ROS生成增多，可引起DNA鏈斷裂，導致核內(nèi)DNA修復酶-聚腺苷二磷酸核糖聚合酶過度激活，適應性地上調(diào)p300及組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)活性，開放抗氧化基因表達以利于DNA修復，但當伴有PKCβ2激活時，通過絲裂素活化蛋白激酶和蛋白激酶B信號途徑，從而使短期、適應性的表觀修飾轉(zhuǎn)變?yōu)殚L期、持續(xù)性的p300激活和組蛋白修飾，即使高糖因素撤出，仍可造成靶細胞的持續(xù)損害[18]。此外，本研究還在AGEs模擬的蛋白非酶糖化記憶模型下，證實p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白在AGEs干預組表達較對照組顯著升高，繼續(xù)正糖培養(yǎng)后各蛋白表達仍顯著上調(diào)，提示AGEs對轉(zhuǎn)錄共刺激子p300及組蛋白乙酰化有記憶效應。研究表明，AGEs可通過AGEs受體(RAGE)，使NF-κB激活，介導RAGE mRNA表達增加，形成RAGE-NF-κB正反饋環(huán)[19]。目前已在多個細胞系中觀察到NF-κB活性受p300及HAT活性的調(diào)節(jié)，因此我們推測一旦AGEs作用于靶細胞，活化RAGE-p300-NF-κB正反饋環(huán)，就可不依賴于AGEs，表現(xiàn)出持續(xù)激活p300的記憶特征。總之，本研究結(jié)果顯示高糖誘導的HMCs p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表達上調(diào)存在記憶效應，且p300及組蛋白乙?；赡芟蹈咛侵翿OS、AGEs、PKCβ2記憶刺激的匯聚點。此不僅將代謝記憶的生化機制和表觀遺傳統(tǒng)一起來，而且亦為關閉代謝記憶探索了新的方向。

志謝：感謝眼科學重慶市市級重點實驗室在本研究中給予的支持！

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