楊海燕，陳光明，崔一民，趙俠，梅川，饒桂榮，莫國玉，楊若才，楊富強

我國是乙型肝炎病毒(HBV)感染的高發(fā)區(qū)，對此類患者目前尚缺乏有效的治療方法[1]。DNA疫苗將編碼HBV病毒外源蛋白的基因表達載體直接導(dǎo)入機體，以激發(fā)機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，從而提高機體細胞免疫功能以清除病毒感染[2-3]。Davis等[4]于1993年證實HBV DNA疫苗能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較強的HBV特異性細胞免疫應(yīng)答，比常規(guī)HBV疫苗更具優(yōu)勢。目前在美國，預(yù)防型和治療型HBV DNA疫苗已進入臨床試驗，初步結(jié)果顯示安全性良好[5-6]。本研究以健康志愿者為研究對象，觀察自行研制的電脈沖(EP)介導(dǎo)的治療性雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗在體內(nèi)的安全性和免疫原性，為下一步臨床研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本試驗篩選足夠多的健康受試者以確保有30名受試者入選研究，分為3個劑量組，每組10名。

1.2 納入及排除標準 納入標準：①25～55歲，已婚已育的志愿者，男女不限；②近5年無乙型肝炎疫苗注射史；③HBsAg、HBeAg、HBeAb、HBcAb陰性；HBsAb陰性，或HBsAb陽性(數(shù)值≤30mU/ml)；ALT及AST正常；④體格檢查：無有臨床意義的陽性體征；⑤胸透：在過去6個月中有醫(yī)學(xué)證據(jù)表明胸透結(jié)果無有臨床意義的異常；⑥心電圖、腹部B超等檢查無異常；⑦自愿參加本臨床試驗，已簽署知情同意書，同意在研究過程中不參加任何其他試驗研究；⑧實驗室檢測指標：血、尿常規(guī)正常；血生化全項(電解質(zhì)、血糖、肝腎功能、血總膽紅素、心肌酶譜、GGT、ALT等)正常；甲狀腺功能正常；腫瘤生化指標(CEA、AFP等)正常；凝血酶原時間正常；自身免疫抗體[抗核抗體(ANA)和抗雙鏈DNA抗體]正常；⑨育齡期婦女，但篩選時妊娠試驗陰性，并且同意在試驗全過程中采取避孕措施者。

排除標準：①任何嚴重的活動性軀體或精神疾病，被研究者認為可能影響試驗的評價或受試者對研究方案的依從。包括但不限于任何腎臟、心臟、肺、血管、神經(jīng)、消化、代謝(糖尿病、甲狀腺疾病和腎上腺疾病)疾病、免疫缺陷病、活動性感染或癌癥；②有過敏性體質(zhì)或藥物過敏史者(青霉素過敏者)；③酗酒或藥物濫用者，或有酗酒或藥物濫用病史，研究者認為會妨礙對試驗的依從性，影響其參加研究或者影響對結(jié)果的解釋；④妊娠期或哺乳期婦女，未婚未育者；⑤拒絕合作或因各種原因不能定期隨訪者；⑥入院前4個月內(nèi)參加過開發(fā)性藥物的試驗，或3個月內(nèi)參加過已批準藥物的試驗，或篩選前1年內(nèi)參加過3個以上藥物試驗研究；⑦受試者不能接受電轉(zhuǎn)染疼痛。

1.3 主要試劑及儀器 常規(guī)生化和血液化驗使用醫(yī)院現(xiàn)有設(shè)備。治療性雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗由廣州拜迪生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)(規(guī)格1mg/瓶，溶液制劑，批號：061101/070101/080101)。電脈沖導(dǎo)入儀由上海交通大學(xué)藥學(xué)院研制(型號TERESAIEPT)?？笻Bs、HBeAg、HBsAg、HBeAb、HBcAb檢測試劑盒購于美國雅培公司。HBV DNA檢測試劑盒購于德國羅氏診斷有限公司。IFN-γ ELISA檢測試劑盒為美國R＆D產(chǎn)品?？购丝贵w、抗雙鏈DNA抗體均購自德國歐蒙公司。

1.4 方法 采用單中心、劑量遞增的試驗設(shè)計。

1.4.1 給藥時間 為0、4、12、24周，共4次。試驗按低、中、高劑量順序進行，在低劑量組最后一名受試者第2次給藥1周后未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)時，中劑量組開始給藥，高劑量組給藥時間以此類推。另外，每個劑量組又分3次進行，先做2例試驗藥物，1周后無明顯異常時再做3例試驗藥物，再過1周后無明顯異常時做5例試驗藥物，具體流程見圖1。組內(nèi)每位志愿者給藥時間間隔不少于1h。每個劑量組隨機分為2組，每組5例，分別使用2種不同輸出電壓(60V和36V)的電脈沖導(dǎo)入。從保護受試者角度出發(fā)，低劑量組在第3次注射后4周仍有60%受試者未產(chǎn)生HBs抗體者及高劑量組第2次注射后已有60%受試者抗HBs陽性時停止試驗。

1.4.2 給藥方式及方法 使用前將治療性雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗的2個質(zhì)粒制劑按1:1配伍混合后于三角肌部位注射，并立即進行電脈沖導(dǎo)入。低劑量組和中劑量組每次注射試驗藥物時，于一側(cè)上臂三角肌部位行肌內(nèi)注射，高劑量組可在一側(cè)上臂的三角肌部位注射4mg或在兩側(cè)上臂的三角肌各注射2mg。

1.4.3 觀察指標 分別于給藥后0、4、12、29周觀察受試者生命體征、物理學(xué)診斷指標(心電圖、胸透、B超)、實驗室檢查指標(血、尿常規(guī)，血液生化，凝血酶原時間，甲狀腺功能，腫瘤標記物)、免疫學(xué)檢測指標[干擾素γ(IFN-γ)、抗核抗體(ANA)、抗雙鏈DNA抗體]、HBV血清標記物(HBsAg、HBcAb、HBeAg、HBeAb、HBV DNA)的變化；于給藥后0、8、12、16、20、24、29周觀察抗HBs的變化。

圖1 健康志愿者試驗分組及給藥流程Fig.1 Grouping and flow-sheet of administration in healthy volunteers

2 結(jié) 果

本研究在北京大學(xué)第一醫(yī)院國家藥品臨床研究基地進行，共納入30例健康志愿者。

2.1 生命體征變化 健康志愿者導(dǎo)入治療性疫苗前后，心電圖、胸透未發(fā)現(xiàn)異常，B超發(fā)現(xiàn)在29周時高劑量60V組中1例脾臟有輕度偏大，可能與用藥有關(guān)，其后自行緩解或恢復(fù)(表1)。

2.2 實驗室檢查指標變化 EP介導(dǎo)的HBV DNA疫苗給藥前后受試者血、尿常規(guī)、凝血酶原時間全部正常，甲狀腺功能和腫瘤標記物檢測指標均在正常范圍內(nèi)。血液生化指標中，低劑量組29周時1例ALT輕度升高；中劑量組4周、29周時共2例BUN輕度升高；高劑量36V組4、12周時2例CK輕度升高；高劑量60V組29周時1例CK輕度升高。以上均可能與用藥有關(guān)，且全部能自行緩解或恢復(fù)(表2)。

2.3 免疫學(xué)指標變化 與用藥前相比，中劑量組IFN-γ下降，可能與用藥有關(guān)。低劑量組第4次未給藥，僅為29周復(fù)查結(jié)果，低劑量組36V和60V在29周各有2例未查IFN-γ?？购丝贵w和抗雙鏈DNA抗體全部陰性(表3)。

2.4 血清學(xué)指標變化 用藥前后健康志愿者HBV血清學(xué)指標全部陰性(表4)。

2.5 免疫原性變化 用藥前后健康志愿者抗HBs在高劑量組36V中較給藥前有升高趨勢，其中1例受試者給藥后達到17.22mU/ml，與用藥有關(guān)，說明治療性HBV DNA疫苗在大劑量組中存在一定的體液免疫原性(表5)。

表1 EP介導(dǎo)的HBV DNA疫苗給藥前后受試者物理學(xué)診斷指標觀察結(jié)果(正常例數(shù)/異常例數(shù)，n=5)Fig.1 Physical diagnosis for volunteers before and after HBV DNA vaccination mediated by in vivo EP (normal cases/abnormal cases, n=5)

表2 EP介導(dǎo)的HBV DNA疫苗給藥前后受試者實驗室檢查指標觀察結(jié)果(正常例數(shù)/異常例數(shù)，n=5)Fig.2 Blood biochemistry and routines of the volunteers before and after HBV DNA vaccination mediated by in vivo EP (normal cases/abnormal cases, n=5)

表3 EP介導(dǎo)的HBV DNA疫苗給藥前后受試者自身免疫學(xué)檢測指標結(jié)果(n=5)Fig.3 Autoimmune response of the subjects before and after HBV DNA vaccination mediated by in vivo EP(n=5)

3 討 論

DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，具有傳統(tǒng)疫苗所不具備的優(yōu)勢，其表達的蛋白質(zhì)可作為內(nèi)源性抗原被遞呈，能夠有效地誘導(dǎo)機體細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的細胞免疫應(yīng)答[7]。DNA疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL可識別和溶解體內(nèi)感染HBV的細胞，可分泌IFN-γ，并可抑制感染細胞內(nèi)的病毒復(fù)制或清除病毒而不引發(fā)細胞損傷[8]。治療性DNA疫苗研制的目的就是提高那些在常規(guī)治療情況下無應(yīng)答、處于免疫耐受期的乙肝患者的HBV特異性細胞免疫水平，力爭打破由HBV長期感染所引起的機體特異性免疫耐受狀態(tài)，促使機體重新恢復(fù)和激活已處于靜息狀態(tài)下的特異性免疫功能，為化學(xué)抗病毒藥治療提供適應(yīng)證，也為那些處于免疫轉(zhuǎn)換期的患者最終清除病毒提供新的手段。

但是，DNA疫苗的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA，其安全性仍然值得關(guān)注。質(zhì)粒DNA與基因組DNA整合的危險性是臨床前研究中應(yīng)該重視的問題，插入的質(zhì)粒DNA可通過誘導(dǎo)染色體斷裂或重組而造成染色體的不穩(wěn)定。我們在臨床前研究工作中采用了盡可能的敏感方法檢測EP介導(dǎo)的雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗的組織分布，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA與宿主基因組DNA的整合，且質(zhì)粒DNA在體內(nèi)代謝較快，不會在組織中長期存留和表達[8-9]。由于雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗中包含了超螺旋雙鏈DNA，且融合表達人源性細胞因子(IL-2/IFN-γ)，臨床前及臨床試驗研究中都要特別考慮免疫系統(tǒng)中細胞或體液調(diào)節(jié)組分可能引起的無法預(yù)料的不良反應(yīng)，如免疫抑制、慢性炎癥、自身免疫或其他免疫學(xué)疾病。從本試驗結(jié)果中可以看出，受試者接受疫苗治療前后生命體征平穩(wěn)，血、尿常規(guī)、血生化、甲狀腺功能、腫瘤標記物等未見明顯異常改變，極少數(shù)出現(xiàn)一過性體檢指標的升高或輕度異常，但全部自行緩解或恢復(fù)；ANA、抗雙鏈DNA抗體全部陰性，未檢出佐劑質(zhì)粒表達產(chǎn)物IFN-γ的升高，說明其自身免疫狀況穩(wěn)定；本臨床Ⅰ期試驗中HBV DNA在治療前后一直處于正常值范圍內(nèi)，說明該疫苗DNA未與宿主細胞基因組DNA發(fā)生整合，提示其遺傳毒理指標是正常、安全的。

表4 EP介導(dǎo)的HBV DNA疫苗給藥前后受試者HBV血清標記物觀察結(jié)果(陰性例數(shù)/陽性例數(shù)，n=5)Fig.4 HBV serology of the volunteers before and aft er HBV DNA vaccination mediated by in vivo EP (negative cases/positive cases, n=5)

表5 EP介導(dǎo)的HBV DNA疫苗給藥前后受試者抗HBs變化觀察結(jié)果(±s, n=5)Fig.5 Serum anti-HBs status of the volunteers before and after HBV DNA vaccination mediated by in vivo EP(±s, n=5)

表5 EP介導(dǎo)的HBV DNA疫苗給藥前后受試者抗HBs變化觀察結(jié)果(±s, n=5)Fig.5 Serum anti-HBs status of the volunteers before and after HBV DNA vaccination mediated by in vivo EP(±s, n=5)

The results at the 29th week are those of the repeated detection in the low-dose group, in which the 4th injection was not given for each subject;There was an elevation of anti-HBs in the high-dose group with 36V EP; "－". No detection

Groups 0 week 8th week 12th week 16th week 20th week 24th week 29th week Low-dose group 36V 0.10±0.11 0.04±0.08 0.16±0.06 0.06±0.11 － － 0.00±0.00 60V 0.07±0.08 0.03±0.05 0.23±0.21 0.11±0.25 － － 0.00±0.00 Middle-dose group 36V 0.08±0.06 0.09±0.13 0.17±0.10 0.17±0.14 0.11±0.13 0.05±0.10 0.08±0.10 60V 0.35±0.72 0.29±0.64 0.38±0.62 0.38±0.40 0.59±1.06 0.59±1.06 0.32±0.41 High-dose group 36V 0.14±0.32 0.33±0.74 0.81±1.81 1.67±2.77 2.02±4.32 2.31±4.38 3.47±7.69 60V 0.03±0.07 0.22±0.32 0.27±0.46 0.35±0.43 0.38±0.43 0.20±0.23 0.08±0.17

從本研究中也不難看出，EP介導(dǎo)的雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗誘導(dǎo)健康受試者體液免疫應(yīng)答的免疫原性較低，可能與DNA疫苗主要是以誘導(dǎo)細胞免疫為主有關(guān)；同時，我們應(yīng)用的佐劑質(zhì)粒將免疫應(yīng)答向Th1方向轉(zhuǎn)化，更有助于細胞免疫應(yīng)答；我們已報道的試驗結(jié)果[10]證實HBV DNA疫苗能夠誘導(dǎo)特異性的細胞免疫功能，充分說明雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗作為治療性疫苗具有其必備的較強的特異性細胞原性。另外，受試者在接受治療前可能已對預(yù)防性乙肝表面抗原疫苗不應(yīng)答或本身為免疫耐受的體質(zhì)，故不易產(chǎn)生較強的體液免疫應(yīng)答。再者，本試驗采用的是兩點肌注聯(lián)合EP介導(dǎo)，因為采用多點肌注聯(lián)合EP介導(dǎo)可能會引起較強的體液免疫應(yīng)答。

綜上所述，HBV DNA疫苗在健康志愿者中是安全的，其在大劑量組中存在一定的體液免疫原性，本研究結(jié)果可為下一步以HBV慢性感染者為研究對象提供依據(jù)，以進一步考察細胞的免疫應(yīng)答。

[1] Liu Y, Xu ZH, Liu LM, et al. Genotypic and phenotypic characteristics of multidrug-resistant hepatitis B virus infection in Chinese hepatitis B patients[J]. Med J Chin PLA, 2012,37(6): 539-543. [劉妍, 許智慧, 劉立明, 等. 我國患者多重耐藥乙肝病毒感染的基因型和表型特點[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2012, 37(6): 539-543. ]

[2] Manchini M, Hudchonel M, Tiollais P, et al. Regulation of HBV mRNA expression in a HBsAg transgenic mouse model by IFN-γ secreting T cells after DNA based immunization[J]. J Immunol, 1998, 161(10): 5564-5570.

[3] Chen GM, Yang FQ. Development and application of therapeutic HBV DNA vaccine[J]. Med J Chin PLA, 2003, 28(6): 489-492.[陳光明, 楊富強. 治療型HBV DNA疫苗的研究與應(yīng)用[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2003, 28(6): 489-492.]

[4] Davis HL, McCluskie MJ, Gerin JL, et al. DNA vaccine for hepatitis B: evidence for immunogenicity in chimpanzees and comparison with other vaccines[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1996, 93(14): 7213-7218.

[5] Tacket CO, Roy MJ, Widera G, et al. Phase 1 safety and immune response studies of a DNA vaccine en coding hepat it is B surface antigen delivered by a gene delivery device[J]. Vaccine, 1999,17(22): 2826-2829.

[6] Thong PL, Kevin M, Coonan Richard C, et al. Safety,tolerability and humoral immune responses after intramuscular administration of a malaria DNA vaccine to healthy adult volunteers[J]. Vaccine, 2000, 18(18): 1893-1901.

[7] Mancini-Bourgine M. Induction or expansion of T-cell responses by a hepatitis B DNA vaccine adm inistered to chronic HBV carriers[J]. Hepatology, 2004, 40(4): 874-882.

[8] Mo GY, Chen GM, Huang ZY, et al. A study of distribution in the tissues and long term toxicity of therapeutic DNA vaccine in mice[J]. Med J Chin PLA, 2003, 28(6): 504-507. [莫國玉, 陳光明, 黃芝瑛, 等. 治療型HBV DNA疫苗在小鼠組織中的分布和長期毒性研究[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2003, 28(6): 504-507.]

[9] Yang FQ, Liu HP, Mo GY, et al. Effect of therapeutic dualplasmid HBV DNA vaccine on immune function in cancrivorous monkeys[J]. Med J Chin PLA, 2008, 33(6): 695-697. [楊富強,劉惠萍, 莫國玉, 等. 治療型雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗對食蟹猴免疫功能的影響[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 33(6): 695-697.]

[10] Yang FQ, Yu YY, Wang GQ, et al. A pilot randomized controlled trial of dual-plasmid HBV DNA vaccine mediated by in vivo electroporation in chronic epatitis B patients under lamivudine chemotherapy[J]. J Viral Hepatitis, 2012, 19(8): 581-593.