譚玉華，孫寶清

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院廣州呼吸疾病研究所，呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510120)

分析靈敏度為檢測系統(tǒng)可檢測的最低分析物濃 度，包括檢測低限(LLD)、生物檢測限(BLD)和功能靈敏度(FS)［1］，而可報(bào)告范圍(RR)指可以報(bào)告的所有結(jié)果的范圍，包含分析測量范圍(AMR)和臨床可報(bào)告范圍(CRR)［2］。免疫球蛋白E(IgE)是Ⅰ型超敏反應(yīng)中的反應(yīng)素，在過敏性疾病診斷中的價(jià)值已得到公認(rèn)，IgE 是正常人血清中含量最低的一種Ig，特別是生兒臍帶血中IgE 含量極低(＜1.0 IU/mL)［3］，臍帶血IgE 升高對變應(yīng)性疾病具有重要預(yù)測價(jià)值［4］，篩選值定為1.2 IU/mL，臍帶血IgE的特異性可達(dá)到95%［5］。在過敏性哮喘、季節(jié)性過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、藥物性間質(zhì)性肺炎、支氣管肺曲菌病、麻風(fēng)、類天皰瘡及某些寄生蟲感染等疾病中IgE 會(huì)有不同程度的升高，特別在過敏性支氣管肺曲菌病時(shí)最為顯著，其血清總IgE 值可達(dá)349～13 000 IU/mL［6］，現(xiàn)血清總IgE 指標(biāo)已列入了變應(yīng)性支氣管肺曲菌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7，8］。除了變應(yīng)性支氣管肺曲菌病和特應(yīng)性皮炎以及在花粉季節(jié)之外，任何血清總IgE 水平大于5 000 ng/mL(2 083.33 IU/mL)的患者均應(yīng)考慮寄生蟲感染的可能性。因此確定總IgE 檢測系統(tǒng)的分析靈敏度和可報(bào)告范圍是重要的分析性能。本研究參考文獻(xiàn)［1，9～11］和EP6-A 文件，觀察自建的總IgE 時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)系統(tǒng)分析靈敏度，并建立可報(bào)告范圍?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料及試驗(yàn)操作要求 TAKEEN-Ⅰ型TRFIA儀及其配套的總IgE 測定試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)量控制品、FWZ-Ⅰ型微量振蕩器、DEM-Ⅲ型全自動(dòng)洗板機(jī)(廣州市豐華生物工程有限公司)。試驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說明書、儀器的運(yùn)行程序及操作規(guī)程操作并確保儀器運(yùn)行處于良好狀態(tài)，分析過程中全程質(zhì)量控制在控。

1.2 樣本制備 以下所用樣本外觀澄清，均無溶血、無脂血和無黃疸。①分析靈敏度試驗(yàn)樣本:將0 IU/mL的校準(zhǔn)品A 作為空白樣本(S0)，將12 IU/mL的校準(zhǔn)品用校準(zhǔn)品A 稀釋成0 IU/mL 、0.25 IU/mL、0.50 IU/mL、1.00 IU/mL、2.00 IU/mL、4.00 IU/mL 和8.00 IU/mL的總IgE 系列分析靈敏度樣品。②AMR 試驗(yàn)樣本:選擇1例低濃度樣本(L，1.21 IU/mL)和1例高濃度樣本(H，2001.01 IU/mL)，為發(fā)現(xiàn)最寬的AMR，將預(yù)期測定范圍加寬至130%左右，L 和H 按照10L、9L+1H、8L+2H、7L+3H、6L+4H、5L+5H、4.5L+5.5H、4L+6H、3.5L+6.5H、3L+7H、2.5L+7.5H、2L+8H、1.5L +8.5H、1L+9H 和10H 進(jìn)行精確混合，每個(gè)濃度水平的樣本量為1.0 mL，形成系列AMR 試驗(yàn)樣品。③CRR試驗(yàn)樣本:選擇3 份高濃度的樣本(1 180.85 IU/mL，1 510.04 IU/mL，1 352.54 IU/mL)，分別用樣本稀釋液作10、20、50、100、200 倍稀釋。上述樣本均外觀澄清，無溶血、無脂血、無黃疸。

1.3 分析靈敏度確定 ①LLD:參考文獻(xiàn)［1，11］將總IgE的S0做20 次批內(nèi)重復(fù)測定，其它系列分析靈敏度樣品做20 批次天間重復(fù)測定，每天均采用雙孔檢測取平均值，采用初始熒光強(qiáng)度值(CPs)表示。計(jì)算20 次S0的CPs的平均值(χ空白)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(s空白)，按99.7%可能性定義LLD，計(jì)算公式為LLD=χ空白+3 s空白，然后轉(zhuǎn)換為濃度單位。②BLD:檢測響應(yīng)量的99.7%單次檢測量最低值也較LLD 大，以LLD的CPs 為界，系列低濃度的分析靈敏度樣品的CPs 結(jié)果中，某濃度下的CPs 均值減去3 倍該樣品的CPs的標(biāo)準(zhǔn)差，仍大于、并與LLD的CPs 最接近的對應(yīng)濃度為BLD，以99.7%的可能性定義BLD，BLD=LLD +3s。③FS:以天間重復(fù)變異系數(shù)(CV)為20%時(shí)對應(yīng)分析靈敏度樣品具有的平均濃度，確定為檢測系統(tǒng)可定量報(bào)告分析物的最低濃度的限值，選擇天間CV 具有或接近20%時(shí)的濃度為FS。

1.4 可報(bào)告范圍建立 ①AMR 確定:參考文獻(xiàn)［2，9，10］和EP6-A 文件［11］將系列AMR 試驗(yàn)樣品在總IgE TRFIA 系統(tǒng)上重復(fù)測定4 次，將實(shí)測值與預(yù)期值作比較，以預(yù)期值為X 軸，實(shí)測值為Y 軸，若所有試驗(yàn)點(diǎn)呈明顯直線趨勢，對數(shù)據(jù)用直線回歸統(tǒng)計(jì)處理。得到Y(jié)=bX+a，若線性相關(guān)系數(shù)(r)≥0.975，且b 在1.00±0.03 范圍內(nèi)，a 接近于0，則可直接判斷該測定系統(tǒng)的AMR 在試驗(yàn)已涉及濃度。②CRR 確定:將系列CRR 試驗(yàn)樣本在總IgE TRFIA系統(tǒng)上重復(fù)測定3 次，實(shí)測值與稀釋后對應(yīng)的預(yù)期值作比較，計(jì)算稀釋回收率，回收率在80%～120%為可接受性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，從而確定樣本最大的稀釋倍數(shù)，ARM 乘以最大稀釋倍數(shù)即為CRR的上限，以FS 為可定量報(bào)告的下限，從而確定了CRR。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 TRFIA 測量所得熒光計(jì)數(shù)采用TRFIA 儀上隨機(jī)配備的分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。其他數(shù)據(jù)采用SPSS13.0 和Microsoft Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分析靈敏度

2.1.1 LLD 總IgE的S0的χ空白和s空白分別為1 137.73和147.31，采用99.7%的可能性計(jì)算檢測低限。LLD=χ空白+3 s空白=1 137.73 +3 ×147.31=1 579.66。若以S0的CPs 平均值為檢測的起點(diǎn)0，那么有99.7%的可能性，每次只做一個(gè)空白時(shí)，出現(xiàn)最高的空白CPs 值較該空白CPs 平均值高3 倍，即441.93，這些CPs 值相當(dāng)于樣品具有的總IgE的量，即為本系統(tǒng)總IgE的檢測低限。將上面所有低濃度分析靈敏度樣品的CPs 值減去空白CPs 平均值，然后求每組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。0.25 IU/mL 總IgE組減去空白后的CPs 平均值為521.35，假定這段范圍內(nèi)總IgE量和CPs 值間呈線性。因此441.93 相當(dāng)于:0.25 ×(441.93/521.35)=0.21 IU/mL。所以本系統(tǒng)總IgE的LLD 為0.21 IU/mL。

2.1.2 BLD 0.50 IU/mL 總IgE組99.7%的最低CPs 值為1554.65－3 ×368.62，即448.79，已大于空白CPs 平均值可能有的最高值441.93，說明0.50 IU/mL的樣品CRs 值有99.7%的可能性，一定大于空白的CRs 值，能定量地報(bào)告結(jié)果。0.50 IU/mL 為本系統(tǒng)總IgE的BLD。

2.1.3 FS 1.00 IU/mL 總IgE組的CV 為19.82%，接近20%。所以，本系統(tǒng)總IgE的FS 為1.00 IU/mL。

2.2 可報(bào)告范圍

2.2.1 AMR 系列AMR 試驗(yàn)樣品的檢測結(jié)果如表3。本研究舍去1.5L +8.5H組、1L +9H組和10H組數(shù)據(jù)，在1.12～1 601.03 IU/mL 范圍內(nèi)，實(shí)測值與預(yù)期值的線性回歸方程為Y=0.9919X +1.1199，R2=1，b 接近于1，且截距與0 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，確定AMR 為1.12～1 601.03 IU/mL。

2.2.2 CRR 本研究的第1 份和第3 份樣本的最大允許稀釋倍數(shù)均為1 ∶100，其稀釋回收率均在80%～120%內(nèi)，則CRR的上限為AMR 乘以最大稀釋倍數(shù)，即1 601.03 ×100=160 103 IU/mL，結(jié)合FS的結(jié)果，確定CRR 為1.00～160 103 IU/mL。

3 討論

根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)化組織《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力的專項(xiàng)要求》(ISO15189)和中國《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》，對檢測系統(tǒng)的主要方法學(xué)性能進(jìn)行驗(yàn)證或評價(jià)證實(shí)其能夠達(dá)到相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)后才能應(yīng)用于臨床檢測［9，10］。分析靈敏度和可報(bào)告范圍是檢測系統(tǒng)自身特性的評估指標(biāo)，分析靈敏度是檢測系統(tǒng)的可報(bào)告定量結(jié)果的最低限，也是整個(gè)可報(bào)告范圍的起點(diǎn)［13］?；颊呓Y(jié)果可報(bào)告范圍，這是評估的前提［12］。如不清楚檢測系統(tǒng)的可報(bào)告范圍，無法選擇樣本作方法學(xué)比較。AMR 指樣本沒有經(jīng)過任何預(yù)處理(濃縮或稀釋)，檢測方法能夠直接測定出待測物的范圍，也就是系統(tǒng)最終的輸出值(活性或濃度)與被測物的活性或濃度呈線性比例的范圍，它反映整個(gè)系統(tǒng)的輸出特性。CRR 是指對臨床、診斷有意義的待測物濃度范圍，此范圍如果超出了AMR，可將樣本通過稀釋、濃縮等預(yù)處理是待測物濃度處于分析測量范圍內(nèi)，最后乘以稀釋或濃縮的倍數(shù)。美國病理學(xué)會(huì)(CAP)要求定量檢測項(xiàng)目須進(jìn)行ARM驗(yàn)證試驗(yàn)，并確定每個(gè)項(xiàng)目的CRR［13］。

檢測系統(tǒng)是完成一個(gè)項(xiàng)目檢測所涉及的儀器、試劑、校準(zhǔn)品、操作程序、質(zhì)量控制、保養(yǎng)計(jì)劃等的組合［14］，在檢測系統(tǒng)正式用來檢測患者標(biāo)本、發(fā)出檢驗(yàn)報(bào)告前，實(shí)驗(yàn)室需對系統(tǒng)的操作分析性能做試驗(yàn)予以驗(yàn)證或評價(jià)證實(shí)。TRFIA 是20 世紀(jì)80年代迅速發(fā)展起來的一種公認(rèn)的最有發(fā)展前途的非放射免疫標(biāo)記技術(shù)，非常適用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)上的超微量分析，其應(yīng)用范圍不斷發(fā)展已經(jīng)成為臨床及治療監(jiān)測和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究等方面的重要手段。本研究對自建的總IgE CTRFIA 定量檢測系統(tǒng)的LLD、BLD、FS、AMR 和CRR進(jìn)行了計(jì)算。結(jié)果顯示本系統(tǒng)LLD 為0.21 IU/mL，BLD 為1.00 IU/mL，F(xiàn)S 為1.00 IU/mL，表明此TRFIA系統(tǒng)檢測總IgE 分析靈敏度高，在臍帶血IgE 定量檢測中具有潛在價(jià)值。CAP 對臨床開展的一些項(xiàng)目提供線性驗(yàn)證品，我國尚未有臨床化學(xué)發(fā)光免疫檢驗(yàn)的線性驗(yàn)證品。線性評價(jià)可采用多種方式進(jìn)行，一種為簡單、客觀的方法，就是評價(jià)測量和預(yù)期濃度之間的關(guān)系是否是直線;另一常見應(yīng)用方法決定非線性是評價(jià)估計(jì)回歸線的殘差及檢驗(yàn)正或負(fù)的偏離是否是隨機(jī)分布［15］。近年來，關(guān)于線性的認(rèn)可趨向于實(shí)際、方便的判斷的做法，而且用患者的結(jié)果可報(bào)告范圍的概念替代了線性，應(yīng)予以關(guān)注。因此本研究采用了第一種簡單直觀的方法，選擇低濃度與高濃度血清按一定比例關(guān)系配制，并將預(yù)期測定范圍加寬至130%左右，在此范圍內(nèi)選擇了更多的濃度水平，這樣形成系列AMR 試驗(yàn)樣品，將實(shí)測值與預(yù)期值作比較，逐漸減少數(shù)據(jù)點(diǎn)直至表現(xiàn)出線性關(guān)系，這樣可發(fā)現(xiàn)檢測系統(tǒng)的最寬的AMR。本研究結(jié)果表明總IgE TRFIA 系統(tǒng)的AMR 為1.12～1 601.03 IU/mL。對于那些高值也有特別臨床意義的檢測項(xiàng)目，并且這些項(xiàng)目的高值高于AMR，CRR的驗(yàn)證或評價(jià)證實(shí)是十分重要的，總IgE 已作為過敏性疾病診斷與鑒別診斷、寄生蟲感染性疾病、免疫功能障礙相關(guān)性疾病的實(shí)驗(yàn)室評估指標(biāo)，在某些疾病中(如過敏性支氣管肺曲菌病)水平升高明顯，超過AMR的結(jié)果均要在最大允許稀釋倍數(shù)內(nèi)進(jìn)行稀釋后檢測。因此本研究通過高濃度樣本稀釋一定倍數(shù)，確定了可最大允許稀釋倍數(shù)為1∶100，得到了本系統(tǒng)的CRR 上限為160 103 IU/mL，并結(jié)合FS，CRR 下限為1.00 IU/mL，在此范圍之外的結(jié)果不可靠。因此對于低值和高值有意義檢測項(xiàng)目應(yīng)對檢測系統(tǒng)的分析靈敏度和可報(bào)告范圍進(jìn)行建立或評價(jià)，能更好的保證檢驗(yàn)質(zhì)量，為臨床提供準(zhǔn)確有效的信息。本研究總IgE TRFIA 檢測系統(tǒng)的LLD、BLD、FS、AMR 和CRR 可滿足臨床需要。

［1］馮仁豐.分析靈敏度(檢測限)［J］.上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2002，17(3):133-136.

［2］陳云峰，葛亮，曹慧玲，等.STAGO-R 血凝儀檢測纖維蛋白原結(jié)果可報(bào)告范圍的探討［J］.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，33(7):859-860.

［3］韓秀蘭，陳育智，聶明，等.正常兒童血清IgE 水平的測定［J］.上海免疫學(xué)雜志，1987，7(2):78-85.

［4］Pesonen M，Kallio M J T，Siimes M A，et al.Cord serum immunoglobulin E as a risk factor for allergic symptoms and sensitization in children and young adults［J］.Pediat Allerg Immunol，2009，20(1):12-18.

［5］Varonier HS，Lacourt GC，Assimacopoulos A.Cord serum IgE and early detection of the atopic phenotype:suitable for routine screening［J］.Eur J Pediat，1991，150(12):844-846.

［6］葉楓，張挪富，鐘南山.變應(yīng)性支氣管肺曲霉病三例并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2009，32(6):434-438.

［7］Walsh T J，Anaissie E J，Denning D W，et al.Treatment of aspergillosis:clinical practice guidelines of the Infectious Diseases Society of America［J］.Clin Infect Dis，2008，46(3):327-360.

［8］Stevens DA，Moss RB，Kurup VP，et al.Allergic bronchopulmonary aspergillosis in cystic fibrosis-state of the art:Cystic Fibrosis Foundation Consensus Conference［J］.Clin Infect Dis，2003，37(Supplement 3):225-264.

［9］鄭松柏，張秀明，莊俊華，等.化學(xué)發(fā)光免疫法檢測甲胎蛋白臨床可報(bào)告范圍的建立［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2008，18(14):2069-2071.

［10］闞麗娟，張秀明，王偉佳，等.電化學(xué)發(fā)光免疫法檢測NT-proBNP的分析測量范圍和臨床可報(bào)告范圍研究［J］.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，32(10):1019-1020.

［11］曹艷林，劉德貝，鄒飛揚(yáng)，等.Chemclin 600 檢測系統(tǒng)測定乙型肝炎病毒表面抗原分析靈敏度與功能靈敏度的驗(yàn)證［J］.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，34(10):1290-1292.

［12］張莉，吳炯，郭瑋，等.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)檢測系統(tǒng)應(yīng)用前的性能評價(jià)［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2006，21(6):560-563.

［13］畢波，呂元.定量檢測方法學(xué)性能驗(yàn)證的系統(tǒng)設(shè)計(jì)［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，30(2):143-145.

［14］李嚴(yán)亮.體外診斷試劑質(zhì)量體系中企業(yè)參考品的管理研究［J］.科技資訊，2013 (12):176-176.

［15］王治國.臨床檢驗(yàn)方法確認(rèn)與性能驗(yàn)證［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2009:138.