趙海蘋 羅玉敏

(首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院腦血管病研究室，北京100053)

微小RNA(microRNAs，miRs)是目前研究最為廣泛的一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長約21～25個核苷酸，由60～110nt的可形成發(fā)夾狀的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄前體加工而成。隨著核酸高通量測序技術(shù)的發(fā)展，miRs基因測序與基因芯片、生物信息學中miRs基因及靶基因預測、多種分子生物學實驗手段結(jié)合，越來越多新的miRs、候選miRs基因以及非保守miRs相繼被發(fā)現(xiàn)［1］。近年來，研究［2］已證實循環(huán)中的 miRs以穩(wěn)定的形式存在于各種體液包括血漿、尿液中，可以作為疾病特異、敏感的生物標記物。miRs主要與靶mRNA分子的3'非編碼區(qū)的不完全互補序列結(jié)合，通過靶向降解mRNA或抑制mRNA翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平達到基因沉默效果。miRs廣泛參與生物發(fā)育，細胞分化、凋亡等多種調(diào)控［3］。近年研究［4］表明，miR-144既是紅系分化的重要調(diào)節(jié)因子，也參與腫瘤、心腦血管病等高發(fā)病率疾病的發(fā)生。已鑒定的哺乳動物miRs，約50%在基因組中成簇存在，并轉(zhuǎn)錄為多順反子的最初轉(zhuǎn)錄本［5］。miR-144前體以 miR-144/miR-451簇形式存在，本文針對miR-144在血液病、癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心臟病等不同系統(tǒng)疾病中的表達變化、作用及機制進行綜述。

1 造血系統(tǒng)疾病

MiRs在造血系統(tǒng)發(fā)育中的調(diào)控作用變得越來越引人注目，目前關(guān)于miR-144研究最多的就是其對紅系形成的作用。用來研究miRs與紅系形成、分化之間關(guān)系的幾種常用實驗體系，包括體外系統(tǒng)如人類胚胎干細胞向紅系分化、用化合物誘導K562和UT-7細胞的血紅蛋白生成、紅細胞生成素處理的正常人或血液病人紅系前體細胞，體內(nèi)系統(tǒng)如斑馬魚胚胎，靶向破壞miRs為研究其在哺乳動物造血系統(tǒng)中的作用提供了有力的工具。

1.1 紅細胞生成與貧血

miR-144參與了紅細胞表型轉(zhuǎn)變，包括調(diào)節(jié)早期紅細胞的成熟和增生，表達胎兒γ－球蛋白基因和去核等過程［4］。Dore等［6］通過基因互補策略結(jié)合基因芯片來鑒定參與紅細胞形成的miRs，發(fā)現(xiàn)miR-144/miR-451是造血關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GATA-1的直接靶點;在體內(nèi)，GATA-1結(jié)合遠端上游調(diào)控原件，激活RNA聚合酶Ⅱ-調(diào)節(jié)的miR-144/miR-451共同前體轉(zhuǎn)錄，敲除斑馬魚胚胎miR-451，則分化為成熟紅細胞的能力顯著減弱。Papapetrou等［7］研究顯示，miR-144/451基因簇在紅細胞中是由一個前體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的，慢病毒敲低miR-144或miR-451可顯著降低Ter119(+)有核紅細胞數(shù)量，同時敲低二者作用加強。使用體內(nèi)一過性報告系統(tǒng)(transient reporter assay in vivo，TRA-In Vivo)，鑒定出羥甲基膽素合成酶(hydroxymethylbilane synthase b，hmbsb)和 krüppel樣鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Krüppel-like transcription factor d，klfd)分別是 miR-451和miR-144的潛在靶基因;進一步使用體內(nèi)生理性轉(zhuǎn)基因報告系統(tǒng)(physiological reporter assay in vivo，PRA-In Vivo)，確定 miR-144真實的靶基因僅為klfd［8］。Fu 等［9］研究顯示，miR-144 在斑馬魚胚胎形成過程中特定階段表達，通過靶向紅細胞特異的轉(zhuǎn)錄因子klfd抑制胚胎的α－球蛋白而不是β－球蛋白基因表達，而klfd選擇性結(jié)合在α－球蛋白和miR-144基因啟動子區(qū)CACCC盒子上激活其轉(zhuǎn)錄，形成負反饋環(huán)路來調(diào)節(jié)胚胎α－球蛋白的表達，miR-144—Klfd通路對球蛋白調(diào)節(jié)的選擇性使其有望成為改善地中海貧血治療的新靶點。Rasmussen等［10］研究顯示，miR-144/451表達依賴于Argonaute 2蛋白(Ago2)，miR-144/451簇缺失小鼠表現(xiàn)為晚幼紅細胞成熟減少、網(wǎng)織紅細胞增生、脾腫大和輕度貧血;miR-451缺失小鼠表型與miR-144/451簇缺失幾乎一樣。另外，miR-144/451簇在應激條件下調(diào)節(jié)基因表達對于穩(wěn)定紅細胞生成至關(guān)重要。miR-144/451敲除導致紅細胞易被氧化劑誘導破壞，miR-144敲除協(xié)同氧化應激可導致斑馬魚胚胎嚴重貧血;miR-451的保護作用通過抑制14－3－3zeta生成，在 miR-144/451(－/－)的有核紅細胞，14－3－3zeta堆積，導致部分FoxO3從核轉(zhuǎn)位到胞質(zhì)，抑制了下游包括抗氧化編碼基因Cat和Gpx1的轉(zhuǎn)錄;在網(wǎng)織紅細胞和成纖維細胞中過表達14－3－3zeta可以抑制FoxO3核轉(zhuǎn)位和活性，而抑制14－3－3zeta可以保護過氧化氫誘導的 miR-144/451(－/－)紅細胞損傷，保存過氧化氫酶活性［11］。與此相反，也有研究［12］顯示miR-144高表達，鐮狀紅細胞貧血更加嚴重，其機制為靶向下調(diào)核因子 E2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，NRF2)，從而降低谷胱甘肽的產(chǎn)生，降低紅細胞的抗氧化能力，闡明了miR-144在紅細胞氧化應激耐受中機制。miR-144/451不僅提供了一個治療血液系統(tǒng)疾病的藥物靶點，還可以作為生物標志物。miR-144/451(eGFP)等位基因，可作為分析造血前體細胞的紅細胞潛能的新工具，可在細胞水平定量分析紅細胞起源［13］。另外，在紅細胞刺激藥物(erythropoiesis-stimulating agent，CERA)注射后27 d，miR-144 在血漿中持續(xù)高表達，因此miR-144可以作為CERA濫用敏感、特異的血漿標志物［14］。

1.2 白血病

MiRs在血細胞生成的過程中是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其表達異常與血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)。伊馬替尼耐藥嚴重影響了慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，CML)的治療，Liu 等［15］發(fā)現(xiàn)c-myc在伊馬替尼耐藥的K562R細胞中上調(diào)，進而提高miR-144/451的表達，而敲低c-myc或恢復miR-144/451可增加細胞對伊馬替尼的敏感性，證明了cmyc和miR-144/451之間的調(diào)節(jié)通路并突出了靶向cmyc或miR-144/451對減輕伊馬替尼耐藥的應用價值。另有研究［16］顯示模擬微重力(modeled microgravity，MMG)能夠改變被輻射的人外周血淋巴細胞(peripheral blood lymphocytes，PBL)miRs表達譜，表現(xiàn)為降低放射敏感的miRs數(shù)量;此外，聯(lián)合使用輻射和MMG 則 miR-144、miR-27a、let-7i*等 miRs表達不發(fā)生變化。研究［17］顯示，miR-144等miRs在CML患者的加速期、急變期、血液病復發(fā)、治療失敗等不同階段和狀態(tài)下的表達有差異;生物信息學分析顯示，其靶基因為與細胞周期和生長調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白比如轉(zhuǎn)化生長因子β型Ⅱ受體(transforming growth factor-beta receptor type-2，TGFBR2)、母親 DPP同源物 4(mothers against DPP homolog 4，SMAD4)、runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(runt-related transcription factor 1，RUNX1)。FLT3基因內(nèi)部串聯(lián)重復(FLT3-internal tandem duplications，F(xiàn)LT3-ITDs)是對60歲以上的細胞遺傳學正常的急性骨髓性白血病(cytogenetically normal acute myeloid leukemia，CN-AML)一個不利診斷標志物，F(xiàn)LT3-ITDs相關(guān)的miRs表達特征包括miR-144和miR-451的下調(diào)［18］，F(xiàn)LT3-ITD鑒定年長的CN-AML患者伴有分子水平的高危險因素是與基因和miRs表達特征有關(guān)，為AML新治療方法提供了生物學的見解。

2 癌癥

MiRs在腫瘤發(fā)生、進展及轉(zhuǎn)移過程中起到重要的作用［19］，miR-144參與了結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、甲狀腺癌、喉癌、惡性間皮瘤的發(fā)病。Wang等［20］通過meta-analysis顯示腫瘤相關(guān)的 miRs，其中包括 hsamiR-144?；蛐酒暮Y查顯示，miR-144在喉癌［21］、惡性間皮瘤(malignant mesothelioma，MM)［22］、甲狀腺濾泡癌(follicular carcinoma，F(xiàn)C)［23］、骨肉瘤［24］中均顯著下調(diào)。Gaedcke等［25］進行了57例直腸癌患者的腫瘤與正常黏膜組織的miRs芯片比較，發(fā)現(xiàn)了49個直腸癌特異 miRs，其中包括 miR-144。Kalimutho等［26］通過篩查結(jié)腸直腸癌(colorectal cancer，CRC)患者排泄物中648個miRs，發(fā)現(xiàn)miR-144*在CRC患者排泄物及直腸樣本中均顯著增加，且在排泄物中穩(wěn)定存在，為CRC診斷預后提供了一種可定量、非侵入性的新方法。Sureban等［27］采用納米技術(shù)將干擾片段NP-siDCAMKL-1轉(zhuǎn)染到人結(jié)腸癌細胞HCT116，抑制其生長，機制包括miR-144依賴的下調(diào)Notch-1的表達。生物信息學分析顯示miR-144的靶蛋白為細胞周期調(diào)節(jié)蛋白Rb1、PTEN，通過抑制Rb1和PTEN的mRNAs翻譯，還可以作用于versican的3'UTR，腫瘤形成實驗證明轉(zhuǎn)染了versican的3'UTR的細胞腫瘤形成較?。?8］。

3 神經(jīng)系統(tǒng)疾病

MiR-144參與了神經(jīng)病和精神病的病理過程［29］。miR-144在坐骨神經(jīng)橫斷面的初級神經(jīng)元中表達下調(diào)［30］，在神經(jīng)卡壓模型脊髓背根神經(jīng)節(jié)中顯著下調(diào)［31］。生物信息學分析［32］顯示，miR-144 與 miR-130、miR-19、miR-101 共調(diào)解 ATXN1、RNF38、ROBO2、ZEB2、NEUROD1、BCL2L11、ERBB4，提示 hsa-miR-144可能是神經(jīng)變性病相關(guān)的 miRs。Persengiev等［33］通過人、黑猩猩、恒河猴的miRs芯片分析發(fā)現(xiàn)miR-144在腦老化、脊髓小腦共濟失調(diào)(spinocerebellar ataxia type 1，SCA1)病理過程中的作用，miR-144在SCA1和Alzheimer患者小腦和皮層中高于年齡相當?shù)恼Ｈ恕iR-144在調(diào)節(jié) SCA1的致病基因(ataxin 1，ATXN1)表達中起主要調(diào)節(jié)作用，抑制miR-144可以提高人細胞中ATXN1的水平。Gu等［34］發(fā)現(xiàn)，胎兒發(fā)生神經(jīng)管缺損(neural tube defects，NTDs)的孕婦血清中miR-144等6個miRs表達上調(diào)，miR-144有潛力成為診斷和預后NTDs的血漿標志物，母體血漿中胎盤miRs為非侵入性產(chǎn)前診斷提供了新的可能。miR-144在長期使用情緒穩(wěn)定劑包括鋰和丙戊酸鈉后的大鼠海馬中顯著上調(diào)［35］。目前使用的抗精神病藥物多數(shù)靶向單胺受體，miRs可以作為新的抗精神病藥物的靶點，目前鑒定的最有希望的治療精神分裂癥的靶點為miR-181、miR-346和miR-195，治療躁郁癥的靶點為 miR-34a 和 miR-144［36］。

4 心血管系統(tǒng)疾病

近年的研究［37］表明，拮抗miRs可望糾正心衰時的不良信號轉(zhuǎn)導徑路，具有成為預防和治療靶標的潛能。室間隔缺損小鼠模型——雙鏈復合蛋白8(paired box gene 8，Pax-8)敲除小鼠心臟中miR-144表達上調(diào)。缺血前適應使心臟中miR-144/451簇表達升高，敲除miR-144/451簇減弱了前適應介導的心臟保護作用，這與靶基因Ras相關(guān)C3肉毒桿菌毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac-1)有關(guān)［38］。另外，miR-144/451簇對心肌缺血再灌注損傷的保護作用，至少部分通過靶向CUG三聚體重復，核糖核酸結(jié)合蛋白2(CUG triplet repeat，RNA binding protein 2，CUGBP2)-COX-2通路實現(xiàn)的，而miR-144/451簇的表達則是由轉(zhuǎn)錄因子GATA-4調(diào)控的［39］。Ovcharenko等［40］證明，導入 let-7c、miR-144 等 miRs會影響Caspase級聯(lián)反應的活性，預測這些內(nèi)源性miRs的靶點包括編碼死亡受體、Caspases和其他凋亡相關(guān)的基因。將miR-144類似物轉(zhuǎn)染至大鼠H9C2心肌細胞中，細胞增生明顯降低、Caspase-3活性明顯升高、細胞凋亡率明顯升高［41］，提示miR-144是促進心肌細胞凋亡的基因。miR-144/451為治療缺血性心臟病、先天性心臟病提供了新的靶點。

5 其他疾病

miR-144在注射鏈脲酶素(streptozotocin，STZ)10周的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中顯著下調(diào)［42］。Karolina等［43］證明，miR-144在2型糖尿病中通過抑制胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1，IRS-1)減弱胰島素信號通路。miR-144在博來霉素誘導的小鼠肺纖維化中顯著下調(diào)［44］。miR-144*在肺結(jié)核患者的單個核細胞中顯著上調(diào)，且miR-144*主要表達在T淋巴細胞中，可以抑制炎癥因子腫瘤壞死因子-α和干擾素-γ的產(chǎn)生以及 T淋巴細胞的增生，證明了 miR-144*在抗結(jié)核免疫反應中的作用［45］。另外，miR-144在小鼠肝組織部分切除后12 h下調(diào)［46］。非編碼miRs在實驗動物的細胞應激反應和突然的環(huán)境改變也起作用。Katsuura等［47］發(fā)現(xiàn)，在健康的日本醫(yī)學生考試后外周血中miR-144/144*顯著升高，miR-144*濃度在考試后變化的百分比與在相同時間點循環(huán)中干擾素-γ和/或 腫瘤壞死因子-α濃度變化的百分比呈顯著的相關(guān)性，證明外周血中miR-144/144*是自然壓力因素的潛在生物標志物。

6 小結(jié)

由于miRs以穩(wěn)定的形式存在于各種體液包括血漿、尿液及糞便中，而miR-144在多種疾病中均發(fā)生顯著的變化，使其可以作為多種疾病特異、敏感的生物標記物，為癌癥、孕婦的產(chǎn)前檢查等提供了一種非侵入性的診斷方法。miR-144在多種系統(tǒng)疾病的作用及機制中均有研究，提示其可以作為一個新的藥物治療靶點，目前研究最多的是血液系統(tǒng)，但其作用存在矛盾之處;而在發(fā)病率、致死率較高的癌癥、心腦血管疾病中的研究較少。另外，miR-144的作用靶點及機制不明確，目前主要采用生物信息學方法對其靶點進行預測居多，部分采用體外熒光素酶報告基因法進行驗證，多數(shù)研究不夠系統(tǒng);且體外細胞實驗居多，體內(nèi)實驗較少，不能夠說明miR-144的整體作用。隨著研究的逐漸深入，miR144將成為治療血液病、癌癥、心腦血管疾病的診斷、治療新靶點。

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