朱文靜， 陳四清， 謝國駟， 李 杰， 田 蕊， 劉宇巖， 邊 力， 胡文革??

(1. 石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 新疆 石河子 832000； 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266071)

抗生素的濫用使得耐藥菌株越來越多，多種藥物對耐藥菌的療效減弱，甚至出現(xiàn)“超級細(xì)菌”[1]，在耐藥菌株大量產(chǎn)生的背景下，中藥卻因靶點(diǎn)多、來源廣等特點(diǎn)未出現(xiàn)明顯耐藥性[2]，所以近年來研究人員對大量中草藥進(jìn)行了篩選提取，以找出更多的抗菌物質(zhì)。陳勇川等[3]研究黃芩苷/黃芩素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗藥性時，發(fā)現(xiàn)黃芩素可顯著逆轉(zhuǎn)耐藥菌對苯唑西林的高度耐藥；胡歡等[4]對卷柏、夏枯草等36種中藥材乙醇提取物體外抗菌活性發(fā)現(xiàn)有15種草藥有廣譜抗菌性；張永剛等[5]研究18種中草藥對哈維氏弧菌抑菌活性發(fā)現(xiàn)僅兩種中草藥無抑菌性；戴碧鑫等[6]對大黃原藥材和藥渣進(jìn)行抗菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其簡單水提液即有抗菌性。中草藥是中國傳統(tǒng)醫(yī)藥精華，對其進(jìn)行抗菌活性篩選有廣闊的開發(fā)前景。

海螵蛸為傳統(tǒng)中藥，又名烏賊骨，《中醫(yī)藥典》[7]把烏賊科無針烏賊(Sepiellamaindroni)或金烏賊(Sepiaesculenta)的干燥內(nèi)殼收錄為海螵蛸。海螵蛸含碳酸鈣、微量元素、氨基酸、殼聚糖等多種成分，其性咸，溫，具有生肌止血，制酸止痛，解毒消炎等功效[8-11]。近年來，學(xué)者們運(yùn)用分離成分等現(xiàn)代方法對海螵蛸的藥理作用和臨床應(yīng)用進(jìn)行研究，證實(shí)其具有中和胃酸[12]、抗?jié)僛13]、成骨[14]、止血[15]等作用。雖然海螵蛸藥用范圍較廣，但在海產(chǎn)品加工中，常作為廢料處理，甚至在藥用過程中還要去掉硬殼層，造成了海螵蛸資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。

目前，對海螵蛸的研究較少，且多集中在臨床治療潰瘍、止血、成骨及其各種成分應(yīng)用等，尚未有關(guān)于其抗菌活性的研究。本研究對金烏賊海螵蛸的簡單水溶物進(jìn)行抗菌試驗(yàn)，待確定其具有抗菌活性后，研究幾種處理對抗菌活性的影響，最后探究金烏賊、曼氏無針烏賊和虎斑烏賊(Sepiapharaonis)三種烏賊海螵蛸對幾種人體和海洋常見致病菌的抗菌性及差異。本研究旨在豐富抗菌中藥材，為海螵蛸抗菌性的開發(fā)利用提供依據(jù)，避免海螵蛸資源浪費(fèi)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 供試藥材 金烏賊、曼氏無針烏賊、虎斑烏賊分別采自于山東、福建、廣東沿海，解剖出內(nèi)骨后，用軟毛刷輕刷表面臟污墨跡等，用蒸餾水沖干后自然晾干。

1.1.2 供試菌株 試驗(yàn)用菌包括：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、哈氏弧菌(Vibrioharveyi)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、白色念珠菌(Candidaalbicans)，其中前五株由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所病研室提供，后三株為標(biāo)準(zhǔn)菌株。

1.1.3 試劑 2216E瓊脂、2216E液體培養(yǎng)基、Mueller-Hinton瓊脂、沙氏葡萄糖肉湯均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，牛肉膏蛋白胨肉湯購自索萊寶科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原材料處理 三種海螵蛸經(jīng)粉碎過50目篩，在烘箱低溫(60 ℃)烘干至恒重，裝于50 mL離心管放干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 藥液原液制備 預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)金烏賊海螵蛸對金黃色葡萄球菌抑制效果明顯，因此通過選用金烏賊海螵蛸不同處理方法藥液對金黃色葡萄球菌的抗菌性的比較，研究確定三種海螵蛸的藥液原液制備方法，具體方法如下(每種方法重復(fù)3個平板)：

步驟A：海螵蛸粉末的初步處理(見表1)。

表1 金烏賊海螵蛸處理方法Table 1 Treatment of cuttlebone

步驟B：海螵蛸的溶劑選擇：稱取海螵蛸2 g，分別加滅菌蒸餾水、滅菌0.9% NaCl 溶液、60%乙醇、80%乙醇、無水乙醇至10 mL，用A確定的最佳方法處理后檢測抗菌效果，選擇抗菌效果最好的溶劑作為最佳溶劑。

步驟C：海螵蛸固液比的確定：分別稱取5.00、3.35、2.50、2.00、1.65 g海螵蛸粉末于離心管，補(bǔ)足B確定的最佳溶劑至10 mL，用A確定的最佳方法處理后檢測抗菌效果，得到最佳固液比。

步驟D：海螵蛸粉末的浸泡時間：用A確定的最佳方法處理、B確定的最佳溶劑、C確定的最適固液比分別在實(shí)驗(yàn)4、6、8、12、24、36 h檢測抗菌效果。

確定好最佳處理方法后，分別稱取三種海螵蛸粉末20 g，按上述篩選的最佳方法處理后，用旋蒸儀在60 ℃以下減壓濃縮成1 g/mL的浸液，經(jīng)過0.22 μm濾膜濾過后放在抗生素藥敏瓶中備用。

1.2.3 藥敏紙片制備 用打孔器對干凈且吸水性較強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)定性濾紙打孔成6 mm 的圓形的濾紙片，并置于潔凈干燥的玻璃培養(yǎng)皿中，在 121 ℃的條件下高壓蒸汽滅菌30 min，滅菌后置于生物安全柜內(nèi)備用。實(shí)驗(yàn)開始時，每個濾紙片加10 μL 1 g/mL的浸液。

1.2.4 微生物培養(yǎng)活化及菌懸液制備 制備牛肉膏蛋白質(zhì)肉湯、沙氏肉湯、2216E液體培養(yǎng)基、2216E瓊脂和Mueller-Hinton瓊脂，121 ℃滅菌15 min，瓊脂冷卻后在無菌環(huán)境倒入培養(yǎng)皿。在生物安全柜內(nèi)，將供試菌株用接種環(huán)接種在其對應(yīng)的液體培養(yǎng)基內(nèi)，28℃搖床恒溫培養(yǎng)18 h，用0.5號麥?zhǔn)媳葷峁艽_定菌液濃度后稀釋至107～108CFU/mL 備后續(xù)的藥敏紙片抑菌實(shí)驗(yàn)用，105～106CFU/mL備后續(xù)的最小抑菌濃度使用。

1.2.5 海螵蛸對受試菌株的抑菌作用 在生物安全柜中，每個平板加100 μL 細(xì)菌肉湯(每個菌種都接種于Mueller-Hinton平板，溶藻弧菌和哈氏弧菌另接入2216E固體平板)，用涂布棒涂板后放上加藥液的濾紙片，設(shè)置四環(huán)素藥敏片作陽性對照組，陽性對照試驗(yàn)一次，三種海螵蛸藥液在每種平板上均重復(fù)3次測定。

將處理好的細(xì)菌平板于 28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h，到培養(yǎng)時間結(jié)束后取出，觀察菌落的生長情況，采用十字交叉方法測量抑菌圈的直徑，記錄數(shù)據(jù)，每組重復(fù)3次，取平均值，抑菌圈直徑>20 mm為極敏，直徑在15～20 mm之間為高敏；直徑在10～14 mm之間為中敏；直徑<10 mm為低敏；直徑<8 mm為無抗菌性[16-18]。最后計算的平均值轉(zhuǎn)換為抑菌率評價抑菌效果。實(shí)驗(yàn)中將抑菌率作為評價抗菌效果的指標(biāo)，抑菌率的計算公式如下：

1.2.6 最小抑菌濃度測定 采用二倍稀釋法測定MIC(Minimum inhibitory concentration)，均按照CLSI 2012版指南進(jìn)行[19](細(xì)菌用MH肉湯培養(yǎng)液，真菌用液體沙氏培養(yǎng)基)。按無菌操作吸取藥液和菌懸液各100 μL于96孔板第1孔至第11孔中，第12孔加入配制溶劑和菌懸液各100 μL作為陰性對照。96孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)24 h，吸取每個不同濃度梯度的藥液接種于普通培養(yǎng)基上，每種藥物3個重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。肉眼觀察藥物最低濃度無細(xì)菌生長，即為該藥的MIC。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

處理方法所得結(jié)果用Excel進(jìn)行平均值計算并作圖；藥敏結(jié)果采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s) 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 海螵蛸的處理方法

2.1.1 滅菌方法 據(jù)表1不同方法滅菌處理的金烏賊海螵蛸粉末藥液抑菌效果見表2。

表2 海螵蛸滅菌方法對抑菌活性的影響Table 2 Effect of cuttlebone sterilization on antibacterial activity

從表2可知，A0雖有抑菌效果，但藥敏紙片周圍有一圈紅色菌落，A1、A2、A3無抑菌效果，A4、A5有效果，A5效果最好。A0粉末未滅菌，自身可能帶有未知菌，因此藥敏紙片周圍會有一圈菌。

2.1.2 溶劑種類 據(jù)1.2.2步驟B不同溶劑處理的金烏賊海螵蛸粉末藥液抑菌效果見表3。

表3 溶劑對抑菌效果的影響Table 3 Effect of solvent on antibacterial activity

表3抗菌圈大小結(jié)果顯示，五種溶劑對海螵蛸藥液抗菌效果的影響是80%乙醇>60%乙醇>無水乙醇>蒸餾水=0.9% NaCl 溶液，80%乙醇處理效果最好。

2.1.3 固液比 據(jù)1.2.2步驟C不同固液比處理的金烏賊海螵蛸粉末藥液抑菌效果見圖1。

圖1 固液比對抑菌活性的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on antibacterial activity

從圖1可以看出，隨海螵蛸粉末比例的降低，藥液抗菌效果先上升后下降，固液比1∶4時抗菌效果最好。

2.1.4 浸泡時間 據(jù)1.2.2步驟D不同時間處理的金烏賊海螵蛸粉末藥液抑菌效果見圖2。

圖2 時間對抑菌活性的影響Fig.2 Effect of time on bacteriostatic activity

從圖2可知，隨浸泡時間的延長，海螵蛸藥液抗菌效果先快速增強(qiáng)，在6 h時達(dá)到最大，隨著浸泡時間的增長，藥液抗菌效果逐漸下降。

2.2 海螵蛸對受試菌株的抑菌作用

稱三種海螵蛸粉末各20 g，依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按固液比1∶4加入80%酒精于錐形瓶中， 80 W超聲波3次，60 ℃，每次20 min，震蕩混合6 h，用旋蒸儀在60 ℃以下減壓濃縮去酒精成1 g/mL的浸液，0.22 μm濾膜過濾。為防止酒精殘留的影響，增加一個80%酒精對照組，100 mL 80%酒精同樣在旋蒸儀旋蒸。在涂布過菌的平板上加上濾紙片，每個濾紙片加10 μL藥液，每種菌重復(fù)3個板，結(jié)果見表4。

表4 三種海螵蛸對8株受試菌的抑菌效果Table 4 Inhibition zones of three cuttlebone against 8 tested strains

由表4可知，三種海螵蛸對銅綠假單胞菌、副溶血弧菌和白色念珠菌均無抑制作用；對金黃色葡萄球菌、溶藻弧菌和哈氏弧菌均有抑制作用，以金烏賊海螵蛸抑制哈氏弧菌效果最好，抑菌圈、抑菌率最大(12.23 mm、103%)；金烏賊和曼氏無針烏賊對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌有抑制作用，虎斑烏賊無抑制作用。

2.3 最小抑菌濃度

測定最小抑菌濃度時，為了防止酒精殘留對菌的影響，同時設(shè)置同條件處理的80%酒精對照管。根據(jù)表4結(jié)果，選取抑菌率>50%的菌種進(jìn)行最小抑菌濃度的測定，測定結(jié)果如表5所示。

表5結(jié)果顯示，金烏賊海螵蛸和曼氏無針烏賊對枯草芽孢桿菌MIC>125 mg/mL，抑制效果較弱，虎斑烏賊無抑制效果；對金黃色葡萄球菌金烏賊海螵蛸和曼氏無針烏賊MIC為31.25 mg/mL，有一定抑制效果，虎斑烏賊MIC>125 mg/mL，抑制較弱；對海洋常見的菌哈氏弧菌和溶藻弧菌金烏賊、曼氏無針烏賊MIC分別為3.9、15.6 mg/mL，虎斑烏賊分別為15.6、31.25 mg/mL，說明金烏賊、曼氏無針烏賊抑制效果好，虎斑烏賊有一定抑制效果。

表5 三種海螵蛸對受試菌的MIC測定Table 5 MIC determination of three cuttlebone against tested strains /(mg·mL-1)

3 討論

3.1 海螵蛸處理方法的比較

海螵蛸是傳統(tǒng)的中藥，具有消炎、制酸止痛作用。不同的處理方法會使海螵蛸抗菌活性發(fā)生變化，本研究結(jié)果表明，中藥常用的水煮法獲得的海螵蛸粉末水煮液對細(xì)菌無效，粉末紫外、高壓處理的也無效，可能是因?yàn)楦邷?、紫外破壞海螵蛸?nèi)對抗菌有效的分子結(jié)構(gòu)。結(jié)合范薏淇等[11]綜述海螵蛸成分含有殼聚糖，殼聚糖多由天然甲殼類動物外骨骼和藻類中提取，具有廣譜抗菌活性[20-22]，超聲波處理組藥液效果最好，可能原因是殼聚糖不易溶于水，超聲波具有滅菌作用，可以幫助部分殼聚糖溶解而不破壞分子結(jié)構(gòu)，因此，用超聲波處理加滅菌蒸餾水的海螵蛸粉末獲得藥液為最佳滅菌方法。

(①金烏賊Sepia esculenta；②曼氏無針烏賊Sepiella maindroni；③虎斑烏賊Sepia pharaonis.)圖3 海螵蛸對各種細(xì)菌的抑菌圈Fig.3 Inhibition zone of cuttlebone against various bacteria

海螵蛸在治療潰瘍創(chuàng)傷時，民間使用方法多是直接撒于創(chuàng)傷處，但直接用海螵蛸粉末測定抗菌活性不便操作，因此試驗(yàn)采用浸泡提取藥液進(jìn)行。根據(jù)湯嘉文[23]論述的中藥抗菌機(jī)制，并結(jié)合李蘭等[24]發(fā)現(xiàn)的海螵蛸主要成分為碳酸鈣，還含有一些其它金屬離子，推測海螵蛸的抗菌作用機(jī)制可能是破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。因海螵蛸碳酸鈣含量高，在80%乙醇溶液中會有部分Ca2+水解出，帶正電荷的Ca2+會和帶負(fù)電的細(xì)菌細(xì)胞膜產(chǎn)生靜電作用，改變和破壞細(xì)菌表面膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)菌死亡[25]，而有些成分，如氨基酸、多糖脂溶性較好，因此純水、純乙醇均沒有80%酒精抑菌效果好。付若秋等[26]研究牡丹皮體外抗菌效果發(fā)現(xiàn)的水提取物強(qiáng)于乙醇提取物，可能與牡丹皮水溶性的抗菌物質(zhì)為主有關(guān)，胡歡[4]對36種中藥抗菌活性研究時所用溶劑與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，說明80%乙醇是海螵蛸的理想提取劑。

唐麗娟等[27]研究海螵蛸多糖的最佳提取條件時，發(fā)現(xiàn)固液比對多糖的提取有影響，推測海螵蛸提取液藥效也會受到固液比影響，本實(shí)驗(yàn)海螵蛸與80%乙醇不同固液比的抗菌效果表明固液比1∶4時抗菌圈直徑最大，效果最好，這一結(jié)果與唐麗娟的研究結(jié)果一致，即固液比影響海螵蛸提取液的藥效，固液比1∶4效果最好。

每種中藥的浸泡提取時間都有一定要求，依據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，金烏賊海螵蛸粉末在不同浸泡時間處理下，4～6 h 藥液抗菌圈增大，6 h后藥液抗菌圈逐漸減小，浸泡6 h的藥液抗菌圈最大。分析原因可能是在6 h前，海螵蛸有效成分未能充分浸泡溶解，6 h左右溶解最好，隨著時間延長，溶解的有效成分在溶液中可能發(fā)生反應(yīng)或變化，從而使藥效減弱。

3.2 海螵蛸抗菌活性的比較

海螵蛸具有治療沙眼[28]、潰爛期褥瘡[29]的功效，沙眼和潰爛期褥瘡會面臨感染細(xì)菌的危險，而用海螵蛸則可治療，說明海螵蛸具有抗菌作用，表4中對8株受試菌的抑菌實(shí)驗(yàn)藥敏性分析顯示，對金烏賊和曼氏無針烏賊海螵蛸金黃色葡萄球菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌表現(xiàn)為中敏，枯草芽孢桿菌表現(xiàn)為低敏，大腸桿菌雖然有抑菌圈，但直徑較小，表現(xiàn)為不敏感；對虎斑烏賊海螵蛸金黃色葡萄球菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌表現(xiàn)為低敏。

實(shí)驗(yàn)中，80%酒精對照組菌落生長均不受影響，而加藥組菌株生長受到明顯抑制，可以排除80%酒精殘留的影響，說明利用80%酒精幫助提取海螵蛸藥液是可行。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，海螵蛸在2216E培養(yǎng)基上，對哈氏弧菌和溶藻弧菌有抑菌效果，在MH培養(yǎng)基上，幾乎無抑菌效果現(xiàn)象，這說明海螵蛸的藥效會受到環(huán)境因子的影響，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

顧青青等[30]對不同產(chǎn)地的海螵蛸核苷類成分測定中發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)核苷類成分差異較大，這一結(jié)果與本研究的三種海螵蛸效果不同有相似之處。顧青青采集的不同產(chǎn)地海螵蛸，來自福建、山東、海南等地，由于沒有進(jìn)行種類鑒定，有可能是不同品種烏賊的海螵蛸，造成成分差異，這也是造成藥效差異的一個重要因素。為此推測海螵蛸的藥效與種類、產(chǎn)地密切相關(guān)。

另外綜合比較抑菌圈與MIC發(fā)現(xiàn)，金烏賊和曼氏無針烏賊的海螵蛸藥液抑菌效果明顯強(qiáng)于虎斑烏賊，與《中國藥典》中僅把前兩種認(rèn)定為海螵蛸一致。而不把虎斑烏賊列為海螵蛸，除了抗菌效果沒有金烏賊和曼氏無針烏賊明顯外，其資源不足也是一大原因。董正之[31]曾對中國近海頭足類分布狀況進(jìn)行統(tǒng)計，黃海區(qū)域占優(yōu)勢的物種是金烏賊、東海區(qū)域占優(yōu)勢的物種是曼氏無針烏賊，而虎斑烏賊則主要分布在西北太平洋和北印度洋等熱帶海域沿海[32-34]。同時，金烏賊作為世界烏賊科中重要的經(jīng)濟(jì)種類之一，年產(chǎn)量在世界烏賊科種類中居第二位[35]，其捕撈量遠(yuǎn)超虎斑烏賊，因而得到的內(nèi)殼量也多。

綜上所述，影響海螵蛸抗菌活性的因素較多，產(chǎn)地、提取方法等都會有影響，而部分中藥常有“體外無效，經(jīng)體內(nèi)代謝后起效”的現(xiàn)象，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)也可能會有很大差距，因此后續(xù)試驗(yàn)可以嘗試進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)。目前對中藥抗菌性的應(yīng)用多聯(lián)合西藥[3,36]，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)海螵蛸抗菌效果較抗生素差，正式應(yīng)用時可與其它藥物聯(lián)合。另外，雖然虎斑烏賊海螵蛸抑菌活性差，但其規(guī)格比金烏賊和曼氏無針烏賊大，在南海有較大的產(chǎn)量，因此作為海產(chǎn)品加工中的副產(chǎn)品，也應(yīng)該進(jìn)一步研究其藥理功能，充分發(fā)揮海洋資源作用。