高川,繆冰旋,馬三梅,周正紅
(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣東 廣州,510632)
葡萄酒是抗氧化的良品。葡萄酒內(nèi)具有抗氧化活性的主要物質(zhì)包括酚、類黃酮、黃烷醇和花色苷物質(zhì)。近幾年,關(guān)于葡萄酒抗氧化的研究主要集中在4個(gè)方面:葡萄酒抗氧化能力的研究方法、抗氧化機(jī)制、葡萄酒不同成分體外的抗氧化能力、葡萄酒不同成分在動(dòng)物體內(nèi)的抗氧化能力。本文主要介紹這4 方面的研究進(jìn)展。
過去常用的檢測(cè)葡萄酒抗氧化能力的方法:1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力、2 ,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid,ABTS)自由基清除能力、銅離子還原能力(cupric ion reducing antioxidant capacity,CUPRAC),氧自由基清除能力(oxygen radical absorbance capacity,ORAC)、羥自由基清除能力(hydroxy radical scavenging ability ,HRSA)、金屬螯合能力(metal chelating ability,MC)和鐵還原能力(ferric reducing ability of plasma,F(xiàn)RAP)等[1]。近幾年來又對(duì)ABTS 法進(jìn)行改良,并產(chǎn)生了用改良型碳糊電極(modified carbon paste electrode,MCPE)間接測(cè)定抗氧化能力的新方法。
李華等對(duì)ABTS 自由基清除能力的測(cè)定方法進(jìn)行了改良。他選取了36 種葡萄酒,其中包括紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒,用福林肖卡比色法(FC)測(cè)定各品種的總酚含量(TPI),并選取了9 種總酚含量具代表性的葡萄酒樣品,然后測(cè)定反應(yīng)不同時(shí)間和稀釋不同倍數(shù)的葡萄酒樣品的抗氧化活性。發(fā)現(xiàn)利用測(cè)定ABTS 自由基清除能力的方法來測(cè)定葡萄酒抗氧化活性的最佳稀釋倍數(shù):紅葡萄酒為0.2∶10 ~0.4∶10;桃紅葡萄酒為1∶10 ~4∶10;白葡萄酒為3∶10~7∶10。最佳反應(yīng)時(shí)間均為2 ~5 min[2]。
沒食子酸含量往往被用來評(píng)價(jià)紅葡萄酒的抗氧化能力。用改良碳糊電極可以測(cè)定沒食子酸。Souza等提出在沒有葡萄糖和VC干擾的紅葡萄酒或白葡萄酒中,可以利用改良碳糊電極間接測(cè)定抗氧化能力。首先使用包含30% (m/m)的碳納米管的改良型碳糊電極,在0.35 V 和Ag/AgCl (KCl 3 mol /L)的條件下進(jìn)行測(cè)定,得到?jīng)]食子酸的含量。在已優(yōu)化的條件下,在濃度為5.0 ×107~1.5 ×105mol/L(檢出限為3.0 ×10-7mol/L),沒食子酸與抗氧化能力的校準(zhǔn)曲線呈線性關(guān)系,根據(jù)結(jié)果可以判斷出紅葡萄酒或白葡萄酒樣品的抗氧化能力[3]。
不同物質(zhì)的抗氧化機(jī)制不同,人們對(duì)抗氧化機(jī)制已經(jīng)有了比較系統(tǒng)的了解。例如:微量元素是與其他物質(zhì)協(xié)同起到抗氧化作用,過氧化氫酶等能將有害自由基轉(zhuǎn)化為無害物質(zhì),而丹參酮等是直接清除自由基的[4]。
酚類物質(zhì):苯環(huán)上任意一個(gè)氫被羥基取代的物質(zhì)。葡萄酒中酚類物質(zhì)的抗氧化能力則是與它們苯環(huán)上的氫被取代的容易程度有關(guān)。隨著科技發(fā)展的進(jìn)步,研究酒類產(chǎn)品抗氧化機(jī)制的新方法和新的抗氧化機(jī)制不斷被發(fā)現(xiàn)。
Neshchadin 于2010 年用化學(xué)誘導(dǎo)動(dòng)態(tài)核極化法(chemically induced dynamic nuclear polarization,CIDNP)對(duì)葡萄酒酚類物質(zhì)的抗氧化機(jī)制進(jìn)行了研究。測(cè)定了4 種含兒茶素多酚的物質(zhì)(兒茶素、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、沒食子酸)的奪氫能力。光誘導(dǎo)氫原子轉(zhuǎn)移到氫萃取物質(zhì)(活躍的異丙基)上并達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)的時(shí)間和分辨周期是:500ns 和1ms。結(jié)果表明:CIDNP 可以作為半定量工具來使用[5]。
Gislason 等證實(shí),酚類混合物清理自由基的能力歸因于它們的氫離子可以被抽提出來。芬頓(Fenton)反應(yīng)下的葡萄酒中的肉桂酸鹽和對(duì)羥基肉桂酸乙酯同樣具有抗氧化能力。Gislason 等發(fā)現(xiàn)肉桂酸α,β 位的不飽和側(cè)鏈可以消除1-羥乙基自由基。這是一種新的清除自由基的抗氧化模式[6]。
對(duì)葡萄酒內(nèi)不同成分在體外的抗氧化能力的研究受到很多科學(xué)家的重視。這方面的研究主要集中在酚類物質(zhì)、多糖、花青素等的體外抗氧化能力。
Sun 等2009 年首次將紅葡萄酒中的酚類物質(zhì)重新分類,分成酚類單體、酚類低聚物、酚類高分子聚合物、花青素和酚類復(fù)合物5 類,并分別測(cè)定每一類的抗氧化活性;還將兒茶酸、表兒茶酸、像黃素、錦葵花素-3-葡萄糖苷從紅葡萄酒中分離出來,并分別測(cè)定其抗氧化活性等[7]。他提出紅葡萄酒中多種酚類物質(zhì)的體外抗氧化能力可以作為葡萄酒抗氧化能力高低的直接證據(jù)。
2009 年,胡博然博士用電子自旋共振(ESR)技術(shù)研究多種干白葡萄酒DPPH 自由基清除能力及總酚含量的關(guān)系。電子自旋共振測(cè)定條件為:干白葡萄酒稀釋倍數(shù)30 倍,反應(yīng)時(shí)間10min。得出的結(jié)果用Origin 8.0 繪圖和數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析。然后用Folin-ciocalteus 比色法測(cè)定總酚含量,最后結(jié)果表明清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的能力與總酚含量呈正相關(guān)[8]。
Aguirre 2009 年對(duì)葡萄酒中多糖的抗氧化能力進(jìn)行了研究。他用整體多糖萃取法得到了純的半乳糖、樹膠醛糖、甘露糖和葡萄糖,然后用凝膠滲透色譜法測(cè)定了其摩爾濃度比(1.0∶0.6∶0.4∶0.2)。結(jié)果表明:紅葡萄酒中的中性多糖具有一定的抗氧化作用,其中中性多糖的混合物PS-SI(主要包括β-(1 - >3)吡喃半乳糖殘基和吡喃半乳糖殘基O -6 位置的側(cè)鏈)的抗氧化能力最強(qiáng)[9]。
花青素也是一種抗氧化物質(zhì)。Goupy 等對(duì)葡萄酒中花青素的抗氧化能力進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)葡萄酒中的花青素和其他某些成分(例如兒茶酸,乙醇和羥基桂皮酸類)結(jié)合而成的化合物都具有較高的抗氧化能力,并將后者稱為葡萄酒色素(RWPs)。Goupy等通過1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力的實(shí)驗(yàn)和在酸性條件下,由亞油酸血紅素誘導(dǎo)過氧化實(shí)驗(yàn)(模擬胃中的抗氧化實(shí)驗(yàn)),測(cè)定花青素和葡萄酒色素的抗氧化能力。結(jié)果表明,葡萄酒色素的1,3 位置連結(jié)是通過(CH)3-CH 橋?qū)崿F(xiàn)的,但是其他色素則是直接進(jìn)行1 -3 連接。相比之下葡萄酒色素連結(jié)得更加緊密,抗氧化性更強(qiáng)[10]。
Noguer 等2008 年首先用逆流色譜技術(shù)(CCC)分析紅葡萄酒成分,發(fā)現(xiàn)葡萄酒的成分由4 部分組成:由高分子聚合物組成的部分、錦葵花素-3-葡萄糖苷、芍藥花青素-3-葡萄糖苷和vitisin A 等。然后通過氧自由基清除能力(ORAC)和鐵還原能力(FRAP)分別檢測(cè)這四部分的抗氧化能力。結(jié)果表明,錦葵花素-3-葡萄糖苷、芍藥花青素-3-葡萄糖苷和vitisin A 的抗氧化能力相似,而且都比高分子聚合物的抗氧化能力高。Noguer 又進(jìn)行體外模擬腸胃消化實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,經(jīng)腸胃消化后,抗氧化能力成百倍增長(zhǎng)[11]。
在生物體中,氧化產(chǎn)生的影響是生命力差、疾病多、衰老快。在體外有明確抗氧化作用的葡萄酒,在生物體內(nèi)復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境是否還有同樣的作用呢?葡萄酒不同成分在動(dòng)物體內(nèi)的抗氧化能力的研究受到很多科學(xué)家的重視。這方面的研究主要集中在大鼠和人類的體內(nèi)試驗(yàn)。
最新的在大鼠體內(nèi)的抗氧化的研究主要集中在葡萄酒對(duì)患糖尿病大鼠、肝癌大鼠、手術(shù)后大鼠的影響以及是否可以延長(zhǎng)大鼠壽命等方面。
4.1.1 患糖尿病大鼠
2012 年,Schmatz 等研究葡萄酒對(duì)糖尿病大鼠的影響。他們首先用鏈脲佐菌素誘發(fā)大鼠患糖尿病,然后測(cè)定白藜蘆醇、咖啡酸、沒食子酸、槲皮素、蘆丁NTPDase(核苷三磷酸diphosphohydrolase)、外生核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶(E-NPP),5'-核苷酸酶和腺苷脫氨酶(ADA)等對(duì)大鼠糖尿病的治療作用。測(cè)定大鼠血漿中血小板凝集性、血漿中的抗氧化酶活性(胞外酶)、核苷酸的水解程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述的多種葡萄酒酚類物質(zhì)都可以降低血小板凝集性,增強(qiáng)胞外酶活性并增加核苷酸的水解程度。這表明葡萄酒和葡萄飲料有助于防止大鼠血小板異常,對(duì)血管并發(fā)癥和糖尿病有防治作用[12]。
4.1.2 患肝癌大鼠
白皮杉醇是從紅葡萄酒中發(fā)現(xiàn)的白藜蘆醇的代謝物。Kita 教授讓患肝癌大鼠服用白皮杉醇。發(fā)現(xiàn)25 ~50muM 的白皮杉醇可以通過抑制細(xì)胞分裂來抑制大鼠的肝癌細(xì)胞的增殖;100 μmol 的白皮杉醇可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式來抑制癌細(xì)胞的增殖。結(jié)果表明白皮杉醇作為一種天然的抗癌物質(zhì),對(duì)于抑制大鼠肝癌實(shí)體瘤和轉(zhuǎn)移的增長(zhǎng)有明顯作用。白藜蘆醇和白皮杉醇可增強(qiáng)大鼠的免疫能力[13]。
血管平滑肌細(xì)胞的增殖容易造成動(dòng)脈粥樣硬化。Kurin 等2012 年對(duì)紅葡萄酒是否可以抑制血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖進(jìn)行了研究。他們選取了4 種多酚類物質(zhì):白藜蘆醇、槲皮素、沒食子酸乙酯和兒茶素。對(duì)健康大鼠分別注射這4 種物質(zhì),觀察其血管平滑肌細(xì)胞的增殖情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)單體多酚的濃度在49.58 ~86.06 mmol/L 時(shí),可以抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖。然后取4 種物質(zhì)等摩爾的不同組合,研究他們的協(xié)同作用或者拮抗作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),每增加一種物質(zhì),抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖能力便增強(qiáng)10.4 倍,即混合物有效抑制濃度變?yōu)?.76 ~8.27 mmol/L。綜上所述,這4 種葡萄酒中的主要成分之間主要是協(xié)同作用,而且對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用[14]。
葡萄酒中的某些物質(zhì),不但有防治疾病的作用,還對(duì)大鼠手術(shù)后身體恢復(fù)有好處。Lin 研究結(jié)果表明葡萄酒中的白藜蘆醇可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)線粒體的生物合成和調(diào)節(jié)細(xì)胞的自噬作用。進(jìn)行結(jié)扎手術(shù)后的大鼠,注射適量白藜蘆醇,可以保護(hù)肝臟,減輕損傷[15]。
da Luz 等選取大量生命力相似的雄性Wistar 大鼠,分別長(zhǎng)期飲用紅葡萄酒(RW)(相當(dāng)于0.15 mg白藜蘆醇(RS)),少量白藜蘆醇飲料(LRS)(0.15 mg),和大量白藜蘆醇飲料(HRS)(400 mg)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期飲用紅葡萄酒和少量的白藜蘆醇飲料的大鼠,p53 的表達(dá)降低了50%。長(zhǎng)期飲用紅葡萄酒的大鼠,p16 降低到大約29%。而p21 都沒有變化。在長(zhǎng)期飲用后大鼠的端粒酶比對(duì)照大鼠增長(zhǎng)了6.5 倍。長(zhǎng)期飲用大量白藜蘆醇飲料和少量白藜蘆醇飲料的大鼠,端粒酶活性增強(qiáng)。3 種處理都增加了有氧工作能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)飲用紅葡萄酒和飲用少量白藜蘆醇飲料都能在一定程度上增強(qiáng)大鼠的生存能力。但是這些大鼠的壽命都沒有變化,都是在673 ±30 d 時(shí)死亡。說明紅葡萄酒和白藜蘆醇雖然無延長(zhǎng)壽命的作用,但是對(duì)于維持生命體健康狀態(tài),還是有作用的[15]。這些研究說明葡萄酒的不同成分可以防治大鼠糖尿病、抑制大鼠肝癌細(xì)胞的增殖、抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)手術(shù)后大鼠的身體恢復(fù),但并不能延長(zhǎng)大鼠壽命[16]。
在體外和動(dòng)物體內(nèi)都表現(xiàn)出良好的抗氧化、抗疾病的葡萄酒,是否真的對(duì)人體有好處呢?
花青素本身也是一種抗氧化物質(zhì),葡萄酒中富含花青素?;ㄇ嗨貙?duì)人體有什么好處呢?Garcia-Alonso 2009 年選擇了紅葡萄酒中的花翠素、花青素、矮牽牛配基、芍藥素、錦葵花素等進(jìn)行研究。通過測(cè)定血漿抗氧化性和健康人體中產(chǎn)生的單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的數(shù)量,來分析各物質(zhì)在人體內(nèi)的吸收情況。首先請(qǐng)7 名志愿者進(jìn)行12 h 通宵禁食,然后供給24 h 測(cè)試餐(除去干擾物質(zhì)),并請(qǐng)志愿者分別飲用12 g 紅葡萄酒并每2 h 提供一份血樣(即每人13 份血樣)。此外,還要收集24 h 的尿液。在血液和尿液中,發(fā)現(xiàn)了花青素苷、芍藥素和錦葵花素葡糖苷酸(glucuronides of peonidin and malvidin)。在攝取實(shí)驗(yàn)餐30 min 后,在血漿中發(fā)現(xiàn)了花青素及其代謝物;1.6h 后,葡萄糖苷達(dá)到了最大值;2.5 h 后葡萄糖醛酸達(dá)到的最大值。24 h 中,花青素量占在總排尿量的(0.05 ±0.01)%。在6 h 的尿液中,就排泄出94%的花青素。盡管在血漿中沒有多少花青素,但是血漿中的抗氧化能力卻不斷增強(qiáng),而且MCP-1不斷下降。說明適度攝入花青素能夠很好的防治冠心?。?7]。
Carluccio 等發(fā)現(xiàn)在地中海區(qū)域的人們經(jīng)常用橄欖油做飯,吃飯時(shí)經(jīng)常飲用葡萄酒。那里的人患心血管疾病的比率很低。他們推測(cè)是橄欖油和葡萄酒能夠起到防治心血管疾病的作用。早期動(dòng)脈粥樣硬化是單核細(xì)胞粘附到內(nèi)皮細(xì)胞引起的。橄欖油和紅酒多酚是否影響內(nèi)皮白細(xì)胞粘附分子的表達(dá)和單核細(xì)胞的粘附性呢?Carluccio 等選取了橄欖油和紅葡萄酒中的橄欖苦苷、羥基酪醇、酪醇和白藜蘆醇進(jìn)行分析。首先用這幾種物質(zhì)分別孵育人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞30 min,然后用細(xì)菌內(nèi)毒素或細(xì)胞因子觸發(fā)粘附分子的表達(dá)。用Northern 分析法和細(xì)胞表面酶免疫法,發(fā)現(xiàn)在一定營(yíng)養(yǎng)濃度下,橄欖苦苷、羥基酪醇和白藜蘆醇,具有明顯的抗氧化活性,能夠降低單核細(xì)胞中血管細(xì)胞粘附基因- 1(VCAM -1)的表達(dá)并減少刺激星蛋白質(zhì)粘附到內(nèi)皮。通過在電泳遷移率分析證明,核因子-κB (nuclear factor-kappa B,NF-κB)mRNA和活化蛋白-1 抑制血管細(xì)胞粘附基因的轉(zhuǎn)錄,而抗氧化物質(zhì)對(duì)核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NFκB)mRNA 和活化蛋白-1 有保護(hù)作用,從而間接對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化有預(yù)防作用。這說明橄欖油和紅葡萄酒中的多酚類抗氧化物質(zhì)有助于抑制內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達(dá)。這些在一定程度上解釋了為什么地中海區(qū)域的居民動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率低[18]。
人體的內(nèi)環(huán)境主要依靠酶和基因進(jìn)行調(diào)控,那紅葡萄酒對(duì)于酶的活性和基因水平表達(dá)有什么影響呢?Fernandez-Pachon(2009)請(qǐng)志愿者每天飲用300 ml紅葡萄酒持續(xù)一周,并且請(qǐng)他們每頓飯吃低酚食物,并在第0、1 和7 天時(shí)取血,進(jìn)行酶活測(cè)定。然后,再控制飲食一周,并且禁止志愿者們飲用葡萄酒或其他酒類,并在第0、1 和7 天時(shí)取血,進(jìn)行酶活測(cè)定。分別對(duì)紅細(xì)胞過氧化物歧化酶(SOD)、血漿(CAT 和GR)和血液(GPx)的過氧化物歧化酶(SOD),過氧化氫酶(CAT),谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和谷胱甘肽還原酶(GR)的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)每頓飯吃低酚食物的人,SOD,CAT 和GR 的活性增強(qiáng)了(P <0.05),并且克服了氧化應(yīng)激對(duì)酶活力的影響。禁止飲用葡萄酒或其他酒類時(shí),這些酶的活性都降低了。然后巨噬細(xì)胞對(duì)各個(gè)酶的基因表達(dá)進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果顯示:酶的活性變化及其基因調(diào)控的結(jié)果并不相同。如過氧化氫酶活性的調(diào)節(jié)不受基因表達(dá)而改變,而過氧化物歧化酶(SOD)基因表達(dá)只有在每頓飯吃低酚食物的的一周中增加。Fernandez-Pachon 的實(shí)驗(yàn)說明適當(dāng)飲用葡萄酒有助于抗氧化酶的表達(dá)并增強(qiáng)其活性,并且在很大程度上,有助于預(yù)防與活性氧氧化有關(guān)的疾病[19]。
有的人對(duì)酒精非常反感,不愿意飲用紅葡萄酒。那無酒精的紅葡萄酒,是否還具有全紅葡萄酒的各種好處呢?Noguer 等2012 年將葡萄酒進(jìn)行脫乙醇處理。第一階段,志愿者們吃低酚含量的食物。第二階段,志愿者們繼續(xù)吃上述食物,并喝300 mL 無酒精紅酒。然后測(cè)定超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶的活性。實(shí)驗(yàn)的第3 天,在2 個(gè)周期(第一階段和第二階段的重復(fù)實(shí)驗(yàn))的研究中,都觀察到了谷胱甘肽還原酶、超氧化物歧化酶活性的顯著提高。實(shí)驗(yàn)第7 天,過氧化氫酶顯著提高。結(jié)果表示,紅葡萄酒的抗氧化作用并不是由于葡萄酒中酒精引起的,而是由于其中的多元酚化合物引起的。因此,無酒精葡萄酒是保護(hù)人體的極好的抗氧化食品[22]。Modun 等在2008 年將葡萄酒進(jìn)行一定處理,包括脫醇,脫酚,并用乙醇和水進(jìn)行對(duì)照,測(cè)定一位健康男性血漿抗氧化能力(用鐵降低抗氧化能力來測(cè)定,F(xiàn)RAP),然后請(qǐng)這位男性隨便飲用一種飲料(全紅葡萄酒、脫醇紅酒、脫酚紅酒、乙醇和水中的一種),在飲料攝入后的30,60,90,120 和180 min分別測(cè)定其FRAP 值。結(jié)果表明脫醇紅酒和脫酚紅酒的FRAP 增加值只是全紅葡萄酒的一半。這證明,紅葡萄酒的抗氧化部分主要包括2 方面,一方面是多酚類物質(zhì),另一方面是血漿尿酸鹽物質(zhì),并且健康人飲用后,體內(nèi)抗氧化性能會(huì)提高[20]。
Beko 等2010 年請(qǐng)21 歲健康的年輕男人和女人每天分別喝0.3 和0.2L 紅葡萄酒并持續(xù)1 個(gè)月。在實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束的時(shí)候取血,并檢測(cè)紅細(xì)胞微量元素含量、紅細(xì)胞和等離子體抗氧化狀態(tài)和血清血常規(guī)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在開始時(shí),女人的微量元素(例如:Zn,Pb)含量以及Zn/Cu 比值明顯比男人高。對(duì)于女人來說,飲用葡萄酒前與飲用后相比,Ca,Mg,Pb,Sr和Zn 含量以及Zn/Cu 比值降低,對(duì)于男人來說,Al,Ca,Li,Pb 和Sr 含量降低。以及兩者的抗氧化能力普遍增高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,男性每日飲用0.3L 葡萄酒,以及女性每日飲用0.2L 葡萄酒不會(huì)出現(xiàn)肝中毒現(xiàn)象,而且在飲用葡萄酒后,無論男女,有害礦物質(zhì)含量均明顯下降[21]。
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