張曉萌 馬普 王洪迪 王秀利

（大連海洋大學水產與生命學院，大連 116023）

作為第三代分子標記的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是基因型和表型之間最好的研究載體，已成為最為理想的遺傳標記之一。隨著DNA測序技術的發(fā)展，SNP分子標記發(fā)展迅速，已廣泛應用于農學、醫(yī)學、生物進化等眾多領域［1]。SNP分子標記的出現(xiàn)極大地促進了遺傳學、基因組學和育種學等相關學科的發(fā)展［2]。近年來，水產動物中的SNPs研究與應用取得了階段性成果，但與人類及高等哺乳類動物差距仍較大，與畜牧業(yè)中的同類研究水平也有較大的差距。本文重點介紹SNPs在水產動物疾病、生長性狀和繁殖性能等方面的研究進展。

1 SNP簡介

1.1 SNP的概念

SNP是指由于單個核苷酸發(fā)生變異而引起的基因組水平上DNA序列的多態(tài)性，其形式包括單個堿基的轉換、顛換、插入和缺失［3]。根據對生物遺傳性狀的影響，SNP可以分為蛋白編碼的SNP和非蛋白編碼的SNP。在蛋白編碼的SNP中，如果編碼序列的改變不影響所翻譯的氨基酸序列則稱為同義蛋白編碼SNP。反之，若編碼序列的改變導致翻譯的氨基酸序列改變從而改變蛋白質的生物學功能或形成終止密碼子使翻譯終止，則稱為非同義蛋白編碼SNP［4]。一個SNP表示在基因組某個位點上有一個核苷酸的變化，而多個核苷酸的變化則表示為SNPs。

1.2 SNP的特點

SNP具有位點豐富且分布廣泛，富有代表性等優(yōu)點。與串聯(lián)重復微衛(wèi)星（SSR）等多態(tài)性相比，SNP是基于單核苷酸的突變，其遺傳穩(wěn)定性與精確性相對較高［5]。另外，SNP在檢測時無需像檢測限制性片段長度多態(tài)性和SSR標記那樣測量片段的長度，而是直接檢測序列變化，從而擺脫了凝膠電泳瓶頸的限制，加上近年來各種新興的技術層出不窮，在提高自動化檢測水平的同時也提高了檢出率，因而其發(fā)展速度較快［1]。

1.3 SNP的篩選和檢測方法

迄今為止已經建立了多種篩選檢測SNPs的技術方法［1，6]，包括等位基因特異寡核苷酸片段分析（allele-specificoligonucleotide，ASO）、 探針技術（TaqMan）、動態(tài)等位基因特異雜交（dynamk allelespecific hybridization，DAS）、限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、直接測序（sequencing）及基因芯片技術（gene chip）。另外，還有以核酸構象為基礎的方法［1，6]，如溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）、毛細血管電泳（capillary electrophoresis，CE）、單鏈構象多態(tài)性（single strand conformational polymorphism，SSCP）和變性高效液相色譜（denaturing high performanceliquid chromatography，DHPLC）等方法，其各有自己的優(yōu)缺點，使用時可根據試驗需求選擇更加高效和經濟的檢測方法。

2 SNPs在水產動物方面的研究進展

2.1 SNPs在水產動物疾病方面的研究進展

在水產動物的養(yǎng)殖過程中，疾病的發(fā)生會直接導致產量下降進而造成經濟損失。為了從遺傳本質上提高養(yǎng)殖動物抗病能力，篩選抗病優(yōu)良個體，以SNP為代表的DNA分子標記已經成為水產動物相關研究的熱點之一。Zhao等［7]利用PCR-SSCP技術對凡納濱對蝦HcSC基因進行多態(tài)性檢測發(fā)現(xiàn) ，3個導致氨基酸序列改變進而影響了HcSC多肽鏈二級結構的SNPs，推測這些SNPs會影響到凡納濱對蝦對不同病原菌的抵抗能力。Lin等［8]克隆了擬穴青蟹的Toll基因，并對其LRRs結構域進行了多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，位于1 372位點A到G的突變頻率達到50%，該突變與擬穴青蟹免疫防御機制有關，會使經弧菌感染后的青蟹死亡率降低。Jeroen等［9]對鯉魚腫瘤壞死因子TNF基因進行克隆和功能分析，在TNF1和TNF2序列3' UTR發(fā)現(xiàn)數個多態(tài)性，并在TNF2編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)一個突變，該突變產生的鯉魚不同基因型個體對擬錐蟲的抵抗能力不同。轉鐵蛋白是鐵代謝過程中的一個多功能蛋白，在先天免疫防御機制中發(fā)揮著重要作用，被作為生物體抗病研究的一個候選基因。García-Fernández等［10]對金頭鯛轉鐵蛋白Tf的基因結構，組成型表達和多態(tài)性進行了分析發(fā)現(xiàn)，平均每253 bp就有一個SNP。進一步研究發(fā)現(xiàn)，這些突變與金頭鯛的免疫系統(tǒng)反應有一定的相關性。另外，Bao等［11]研究了海灣扇貝中超氧化物歧化酶SOD基因多態(tài)性及其與鰻弧菌敏感性。在3種SOD基因中共發(fā)現(xiàn)59個SNPs，且大部分發(fā)生在啟動子上。其中位于AiCuZnSOD啟動子-1 739位T-C的突變與AiECSOD啟動子-498位A-T和-267位G-A的突變與海灣扇貝抗鰻弧菌性能顯著相關（P<0.05）。位于Ai-ecCuZnSOD基因-38位C-A的突變導致其信號肽第13位的蘇氨酸變?yōu)橘嚢彼幔疫M一步研究發(fā)現(xiàn)該位點為蘇氨酸的野生型個體對抗鰻弧菌的能力相對較高（P<0.05）。Li等［12]研究發(fā)現(xiàn)，位于櫛孔扇貝溶菌酶基因啟動子區(qū)的SNPs會影響櫛孔扇貝對鰻弧菌的抵抗能力。Siva等［13]對櫛孔扇貝抗鰻弧菌能力與肽聚糖識別蛋白（PGRP）基因多態(tài)性之間的相關性進行了研究發(fā)現(xiàn)，位于PGRP基因上的SNPs也會影響到櫛孔扇貝對鰻弧菌的抵抗能力。

2.2 SNPs在水產動物生長性狀方面的研究進展

水產養(yǎng)殖動物最為重要的經濟性狀是生長性狀，包括體長、體重和體高等。因為這些性狀的優(yōu)劣直接影響到經濟效益的高低。尋找與生長性狀相關基因的多態(tài)性，并對多態(tài)性與性狀之間的關聯(lián)性進行分析將會為水產動物分子育種奠定基礎。Wang等［14]利用PCR-SSCP技術和DNA測序的方法對103個櫛孔扇貝個體的肌肉生成抑制素基因MSTN的多態(tài)性進行了篩選，并分析了其與生長性狀的關聯(lián)性。結果顯示，位于該基因外顯子2第327位A-G的突變導致其編碼的氨基酸由蘇氨酸變?yōu)楸彼?，位于外顯子3第289位C-T的突變導致其編碼的氨基酸由半胱氨酸變?yōu)榫彼帷＿M一步的單因素方差分析顯示第327位為G的純合體，個體有顯著增高的體重、軟組織量、內收肌量、殼長和殼高。Zhu等［15]利用同樣的方法對黃鯰魚MSTN基因進行多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，存在于該基因中的SNPs同樣影響到黃鯰魚的體長、體寬、體高和體重。同樣有研究發(fā)現(xiàn)，大比目魚MSTN基因中啟動子區(qū)域355位點存在T-C的突變，并且該位點為C的純合體，雌性大比目魚體長和體重相對較高（P<0.05）［16]。Wang等［17]對具有不同生長性狀的2種文蛤群體的205個個體的FBA基因進行了多態(tài)性檢測，共發(fā)現(xiàn)4個SNPs，這些SNPs均會影響文蛤的能量代謝水平，從而推測可能與其體重相關。同樣，對文蛤磺基轉移酶MmeSULT基因的多態(tài)性分析顯示在該基因中存在3個SNPs位點，其中位于MmeSUl-806位的突變與生長性狀顯著相關（P<0.05），可以作為文蛤連鎖圖譜構建的基因標記［18]。張麗等［19]分析了紅鰭東方鲀黑皮質素受體4（MC4R）基因編碼區(qū)的多態(tài)性，并于該基因48位和264位發(fā)現(xiàn)G-A的轉換突變，兩處點突變均未引起氨基酸改變，為同義突變，最小二乘分析結果顯示兩個突變位點對紅鰭東方鲀的體重、體長、體高均沒有顯著性影響，可能是試驗樣本數太小造成的。此外，還有大量水產動物SNPs的研究，如Gross等［20]發(fā)現(xiàn)了能影響大西洋鮭體重的SNP，這個SNP存在于GH基因上。還有報道稱，存在于太平洋牡蠣THLGC閱讀框和PCHGS閱讀框中的SNPs會影響其內收肌的表達水平［21]。

2.3 SNPs在水產動物繁殖性能方面的研究進展

克隆與水產動物繁殖性能相關的基因并分析其多態(tài)性與繁殖性能之間的關聯(lián)，將有助于解析水產動物生殖內分泌的遺傳調控機制，為提高水產動物的繁殖能力奠定基礎。FOXL2基因在卵巢發(fā)育和粒層細胞分化過程中發(fā)揮著重要的作用，具有維護卵巢功能的作用。Shi等［22]利用PCR-SSCP技術對52個雌性牙鲆的FOXL2基因做了多態(tài)性檢測，共發(fā)現(xiàn)5個多態(tài)性位點，分別為SNP1［A540C（Asn102His）和A591G（Asn119Asp）] ，SNP2［G864A（Lys210Glu）和G875A] 及SNP3（C1169A）。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，SNP1與性腺指數（GSI）顯著相關（P<0.05），SNP2與血清雌二醇水平呈顯著相關（P<0.05），位于3'UTR的SNP3與肝指數（HSI）顯著相關（P<0.05）。該研究表明FOXL2基因可以作為牙鲆分子輔助育種的候選基因。馬瑞芹［23]在牙鲆CYP17-I、CYP17-Ⅱ和CYP19A基因調控區(qū)發(fā)現(xiàn)的SNPs，影響到牙鲆血漿中睪酮（T）水平和性腺指數（GSI），與牙鲆的繁殖性能存在顯著性相關。另外，海膽中的Runx基因能影響胚發(fā)育并與全身的細胞發(fā)育與分化有關。葛輝等［24]在馬糞海膽Runx基因中發(fā)現(xiàn)兩處突變，分別為A663T的錯意突變和C728T的同義突變。該錯義突變使密碼子編碼的氨基酸由天冬氨酸變?yōu)槔野彼?，推測可能會導致Runx基因表達產物的變化，進而會影響海膽的生理機能和繁殖性能。Wang等［25]發(fā)現(xiàn)蝦夷馬糞海膽Runt-1基因（Runx基因家族成員之一）833位G到A的同義突變會導致該位點為G的純合體個體比該位點為A的純合體個體有顯著增高的性腺重量（P=0.029）。

2.4 SNPs在水產動物其他方面的研究進展

在制作水產動物的基因圖譜方面，SNP分子標記發(fā)揮著無法取代的作用。而制作遺傳圖譜對于深入研究水產動物基因組的相關功能和繁育優(yōu)良水產品種都是十分重要的。Castao-Sánchez等［26]利用SNP分子標記構建出了日本比目魚的基因圖譜。Moen等［27]利用SNP標記為大西洋鱈魚建立了遺傳連鎖圖譜。 Stickney等［28]利用SNP和寡核苷酸微陣列技術構建了斑馬魚的遺傳圖。Abadía-Cardoso等［29]利用已知基因組數據庫中的EST序列設計引物對虹鱒魚480個基因進行了多態(tài)性分析，為構建虹鱒魚的遺傳圖譜奠定了基礎。He等［30]對藍鯰魚和斑點叉尾鮰的EST序列進行了比較分析發(fā)現(xiàn)，每100 bp就有1.32個SNPs，該研究結果有利于藍鯰魚和斑點叉尾鮰的種間資源家系遺傳圖譜的構建。此外，Garvin等［31]發(fā)現(xiàn)存在于太平洋北部不同區(qū)域的大麻哈魚種群中的SNPs嚴重影響了大麻哈魚在海洋中分布情況。

3 結語

SNPs 已在玉米、大豆、雞及豬等動植物育種和生產中有許多應用研究，主要集中在輔助育種、基因定位等方面［32，33]。盡管水產動物的SNPs研究起步較晚，但已取得了一些進展。今后，對水產動物SNPs位點的批量發(fā)掘及其與性狀的關聯(lián)性驗證是水產動物分子標記育種研究的重點方向之一。

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