孫紅梅 王騰飛 李丕武 唐衛(wèi)華 曲麗娜 王瑞明

隨著世界上許多國家限制或禁止對抗生素的使用，抗生素作為飼料添加劑的時代即將過去，益生菌是最先被提出的替代品［1］。益生菌（Probiotic）是通過改善宿主腸道菌群生態(tài)平衡而發(fā)揮有益作用，達(dá)到提高宿主（人和動物）健康水平和健康佳態(tài)的活菌制劑及其代謝產(chǎn)物［2］。布拉德酵母菌主要有強化腸黏膜組織和釋放B 族維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，提高動物的營養(yǎng)素的吸收和利用，減少營養(yǎng)性腹瀉，提高生長速度，調(diào)節(jié)機體局部免疫功能來抵抗病毒的侵襲等功能［3］。乳酸菌，特別是乳桿菌，是定植在人和動物胃腸道的微生物類群中最多、最重要的一種，主要有拮抗病原微生物，調(diào)節(jié)動物消化道微生物區(qū)系平衡，活化免疫系統(tǒng)，增強免疫力等功能［4，5］。芽孢桿菌具有抑制其它外來病原微生物在胃腸道內(nèi)的定植或增殖的作用，并且具有較強的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性［6］。仔豬因腸道內(nèi)尚未建立穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)，易受各種病原微生物的侵襲導(dǎo)致仔豬腹瀉，仔豬腹瀉容易引起仔豬死亡，嚴(yán)重降低了養(yǎng)豬生產(chǎn)者經(jīng)濟效益，益生菌在預(yù)防和治療仔豬腹瀉中以其安全、無副作用、效果好的特點受到越來越多的青睞。若要使益生菌充分發(fā)揮其有益作用，必須保證其在腸道內(nèi)的存活率，通過耐酸、耐膽鹽試驗及拮抗病原菌試驗研究，驗證3種潛在益生菌的耐受性及對病原菌的拮抗作用，為3種潛在益生菌在飼料生產(chǎn)實踐中的推廣和應(yīng)用提供諸多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌種 布拉德酵母菌（Saccharomyces boulardii），地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），大腸桿菌（Escherichia coli），金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus），以上菌株均為山東省微生物工程重點實驗室保藏。

1.1.2 試驗用培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基：葡萄糖2％，蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母提取物0.5％，檸檬酸二胺0.2％，磷酸氫二鉀0.2％，MgSO4·7H2O 0.058％，MnSO4·H2O 0.025％，吐溫80 1mL/L，乙酸鈉0.5％，pH6.8。

沙氏培養(yǎng)基：葡萄糖2％，蛋白胨1％，pH5.5。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨1％，NaCl 1％，酵母粉0.5％，pH7.5。

高濃度鹽水營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.03％，NaCl 7.5％，pH7.2。

伊紅美蘭培養(yǎng)基：蛋白胨1％，乳糖1％，磷酸氫二鉀0.2％，2％伊紅溶液2％，0.5％美蘭溶液2％。

上述培養(yǎng)基均121℃、20min滅菌。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制備 將斜面上的地衣芽孢桿菌接種于無菌LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8-12h備用；將穿刺培養(yǎng)的乳酸菌分別接種于無菌MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)18-24h備用；將斜面上的布拉德酵母菌接種于無菌沙氏培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24-30h備用；將斜面上的大腸桿菌接種于無菌LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8-12h備用；將斜面上的金黃色葡萄球菌接種于無菌LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12-24h備用。

1.2.2 耐酸性試驗 配置pH值1.0、2.0、3.0、4.0和5.0的無菌生理鹽水，取上述制備好的布拉德酵母菌液1mL，在pH值1.0、2.0、3.0、4.0和5.0的無菌生理鹽水中稀釋100倍。將稀釋液放入恒溫培養(yǎng)箱中靜置1、2、3和4h。到時間取出的稀釋液用無菌的生理鹽水進(jìn)行十進(jìn)制的梯度稀釋，利用平板菌落計數(shù)法計數(shù)。試驗重復(fù)3次。地衣芽孢桿菌和植物乳桿菌的測定方法同上。

1.2.3 耐膽鹽濃度試驗 配置膽鹽濃度分別為0％、0.05％、0.1％、0.2％和0.3％（W/V）的無菌生理鹽水，取上述制備好的布拉德酵母菌液1mL，在膽鹽濃度分別為0％、0.05％、0.1％、0.2％和0.3％（W/V）的無菌生理鹽水中稀釋100倍。將稀釋液放入恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)0、1、2、3和4h。到時間取出的稀釋液用無菌的生理鹽水進(jìn)行十進(jìn)制的梯度稀釋，利用平板菌落計數(shù)法計數(shù)。試驗重復(fù)3次。地衣芽孢桿菌和植物乳桿菌的測定方法同上。

1.2.4 拮抗病原菌試驗 各取制備好的3種益生菌和金黃色葡萄球菌菌液1mL在4℃，5000r/min離心條件下離心10min，菌體用無菌的生理鹽水沖洗，然后將3種益生菌菌體分別與兩種病原菌混合懸浮在無菌的生理鹽水中。37℃靜置培養(yǎng)4h，取樣，用平板菌落計數(shù)法活菌計數(shù)。菌落計數(shù)培養(yǎng)基用無菌高濃度鹽水營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。試驗重復(fù)3次。拮抗大腸桿菌測定方法同上。菌落計數(shù)培養(yǎng)基用無菌伊紅美蘭培養(yǎng)基。

1.2.5 試驗數(shù)據(jù)處理 將3次平行試驗所得數(shù)據(jù)取平均值。

2 結(jié)果

2.1 耐酸性試驗結(jié)果

布拉德酵母菌、地衣芽孢桿菌和植物乳桿菌在處理前的存活數(shù)（log CFU/mL）分別為8.10、8.60和9.49，圖1-圖3顯示，當(dāng)pH為4.0和5.0時，布拉德酵母菌、地衣芽孢桿菌和植物乳桿菌的存活數(shù)在培養(yǎng)至4h均沒有明顯下降；當(dāng)pH為3.0時，植物乳桿菌的存活數(shù)沒有明顯下降，布拉德酵母菌菌株稀釋液經(jīng)過2h培養(yǎng)后，存活數(shù)為處理前的57.4％，隨著時間的推移，菌株數(shù)量明顯下降。地衣芽孢桿菌菌株稀釋液經(jīng)過3h培養(yǎng)后，存活數(shù)為處理前的64％，隨著時間的推移，菌株數(shù)量明顯下降，但仍有一定的菌株存活；當(dāng)pH值為1.0和2.0時，3種潛在益生菌菌株稀釋液經(jīng)過1、2、3和4h培養(yǎng)后，菌株數(shù)量有明顯下降，但仍有一定量的菌株存活。

圖1 布拉德酵母菌在不同pH生理鹽水中培養(yǎng)的存活數(shù)

圖2 地衣芽孢桿菌不同pH生理鹽水中培養(yǎng)的存活數(shù)

圖3 植物乳桿菌不同pH生理鹽水中培養(yǎng)的存活數(shù)

2.2 耐膽鹽濃度試驗結(jié)果

由圖4-圖6可見，當(dāng)豬膽鹽濃度分別為0.05％和0.1％（W/V）時，布拉德酵母菌、地衣芽孢桿菌和植物乳桿菌的存活數(shù)沒有明顯下降；當(dāng)膽鹽濃度為0.2％和0.3％（W/V）時，地衣芽孢桿菌和植物乳桿菌的存活數(shù)與豬膽鹽濃度為0％相比，存活數(shù)沒有明顯下降，布拉德酵母菌的存活數(shù)有一定的下降，但仍有一定數(shù)量的存活數(shù)。

圖4 布拉德酵母菌在不同膽鹽濃度（W/V）生理鹽水中培養(yǎng)的存活數(shù)

圖5 地衣芽孢桿菌在不同膽鹽濃度（W/V）生理鹽水中培養(yǎng)的存活數(shù)

圖6 植物乳桿菌在不同膽鹽濃度（W/V）生理鹽水中培養(yǎng)的存活數(shù)

2.3 拮抗病原菌試驗結(jié)果

由圖7和圖8可見，布拉德酵母菌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用較強，其中布拉德酵母菌對大腸桿菌的抑制率達(dá)到75.9％，對金黃色葡萄球菌的抑制率達(dá)到61.3％；地衣芽孢桿菌對金黃色葡萄球菌的抑制作用較強，抑制率達(dá)到72.3％，對大腸桿菌的抑制作用較弱，抑制率僅為56.4％；植物乳酸菌對大腸桿菌的抑制作用較強，抑制率達(dá)到63.1％，對金黃色葡萄球菌的抑制率僅為41.8％。

3 討論

飼料益生菌飼喂斷奶仔豬，若想發(fā)揮其益生作用，必須經(jīng)受斷奶仔豬胃內(nèi)的酸性環(huán)境和消化系統(tǒng)中一定的膽鹽濃度，才能在腸道內(nèi)存活并發(fā)揮其有益作用［7］。由于斷奶仔豬體內(nèi)胃腸道消化環(huán)境中，胃酸的 pH 值約為3.0-6.0，食物通過胃的時間相對較短，一般為1h左右，且存在一定濃度的膽鹽，豬消化道中膽鹽含量約為0.03％-0.3％，因此有些益生菌進(jìn)入消化道后，不能有效地抵抗胃酸、膽鹽的作用，無法到達(dá)腸道或定植腸道而發(fā)揮有益作用［8］，成為目前飼用益生菌仍存在的問題，針對這些問題，研究工作者應(yīng)進(jìn)一步選育生產(chǎn)性能高、耐受性強的菌種。

圖7 三種潛在益生菌對大腸桿菌的抑制率

圖8 三種潛在益生菌對金黃色葡萄球菌的抑制率

本試驗體外模擬仔豬消化道酸性和膽鹽環(huán)境，研究的3種潛在益生菌對酸及膽鹽均具有較好的耐受性。布拉德酵母菌由于其特殊的外壁結(jié)構(gòu)而對酸性和膽鹽環(huán)境都有較好的耐受性。植物乳桿菌為以乳酸為唯一或主要代謝產(chǎn)物的細(xì)菌，故對酸性環(huán)境十分適應(yīng)，當(dāng)pH為3.0時，植物乳桿菌的存活數(shù)都沒有明顯下降。地衣芽孢桿菌是兼性厭氧菌，它在一定條件下能產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生孢子，是具有應(yīng)用潛力的菌種之一，本研究與Cenci［9］和董尚智等［10］的研究都發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌具有良好的耐酸性。地衣芽孢桿菌屬于耐膽鹽菌株，這與董尚智的結(jié)果基本一致，主要是芽孢桿菌的芽孢衣可維持芽孢膜的表面張力，使芽孢桿菌對膽鹽表現(xiàn)出較強的耐受性。

斷奶仔豬腹瀉疾病史飼養(yǎng)過程中常見病，其中病原微生物的侵襲導(dǎo)致的腹瀉給養(yǎng)豬業(yè)造成了較高的經(jīng)濟損失，可引起仔豬腹瀉的病原微生物主要有大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌等。試驗選用兩種病原微生物即大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，初步驗證3種潛在飼料益生菌對兩種病原菌均有一定的拮抗作用，其中布拉德酵母菌可抑制病原微生物的繁殖，對大腸桿菌的抑制率達(dá)到75.9％。目前，芽孢桿菌的抑菌作用主要認(rèn)為是在生長代謝過程中能產(chǎn)生蛋白多肽類抗菌物質(zhì)和大量的溶菌酶，直接抑制病原菌的生長繁殖，地衣芽孢桿菌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有明顯的抑制作用，對金黃色葡萄球菌的抑制率達(dá)到72.3％，此次研究與王美秀［11］和來航線［12］的結(jié)果基本一致。乳酸菌的抑菌作用主要認(rèn)為是能夠分解糖類產(chǎn)生乳酸，降低環(huán)境pH值，產(chǎn)生細(xì)菌素抑制或殺死病原菌，植物乳桿菌對大腸桿菌的抑制率達(dá)到63.1％。本次研究為3種菌株作為益生菌提供了一定的理論依據(jù)。

初步驗證試驗用3種潛在益生菌可以耐受仔豬消化道內(nèi)的酸性環(huán)境及膽鹽濃度，并且有可能通過拮抗病原菌的作用對仔豬產(chǎn)生益生作用，為3種菌株作為仔豬飼料益生菌提供了部分試驗依據(jù)和潛力。

4 結(jié)論

當(dāng)pH為3.0時，植物乳桿菌經(jīng)過4h培養(yǎng)后存活數(shù)沒有明顯下降；當(dāng)pH為4.0和5.0時，布拉德酵母菌、地衣芽孢桿菌和植物乳桿菌的存活數(shù)經(jīng)4h培養(yǎng)，均沒有明顯下降。當(dāng)膽鹽濃度為0.2％和0.3％（W/V）時，地衣芽孢桿菌和植物乳桿菌的存活數(shù)沒有明顯下降。布拉德酵母菌對大腸桿菌的抑制率達(dá)到75.9％，地衣芽孢桿菌對金黃色葡萄球菌的抑制率達(dá)到72.3％，植物乳桿菌對大腸桿菌的抑制率達(dá)到63.1％。

［1］Abe F, Ishibashi N, Shimamura S. Effect of administration of bifidobacteria and lactic acid bacteria to newborn calves and piglets［J］. Dairy Sci, 1995, 78（12）：2838-2846.

［2］Trafalska E, Grzybowska K. Probiotics-an alternative for antibiotics？［J］. Wiad Lek, 2004, 57（9-10）：491-498.

［3］Buts JP. Twenty-five years of research onSaccharomyces boulardiitrophic effects：updates and perspectives［J］. Dig Dis Sci, 2009,54：15-18.

［4］王凱, 馬金磊, 賴婷, 等.乳酸菌劑對斷奶仔豬腸道生理指標(biāo)的影響［J］.中國獸醫(yī)雜志, 2008, 44（9）：21-23.

［5］魏愛彬, 于潔, 王鑫, 等.益生乳酸菌Lactobacillus caseiZhang和Lactobacillus plantarumP8對全價飼料pH及微生物類群變化的研究［J］.微生物學(xué)雜志, 2012, 32（2）：1-8.

［6］馬鑫, 郭宏, 張寶國, 等.地衣芽孢桿菌作為飼料添加劑的研究進(jìn)展［J］.中國飼料添加劑, 2011, 2：10-13.

［7］Silva MLF, Lima JAF, Cantarelli VS, et al. Probiotics and antibiotics as additives for sows and piglets during nursery phase［J］. Revista Brasileira de Zootecnia, 2010, 39（11）：2453-2459.

［8］趙曉明, 李世丁, 郭鳳英.早期斷奶仔豬消化道環(huán)境變化與營養(yǎng)調(diào)控［J］.飼料工業(yè), 2003, 24（4）：45-46.

［9］Cenci G, Trotta F, Caldini G. Tolerance to challenges miming gastrointestinal transit by spores and vegetative cells ofBacillus clausii［J］. Journal of Applied Microbiology, 2006, 101（6）：1208-1215.

［10］董尚智, 王國霞, 陳遠(yuǎn)鳳, 等.飼用地衣芽孢桿菌的生物學(xué)特性研究［J］.飼料研究, 2009, 7：14-18.

［11］王美秀, 張愛榮, 郝永清.奶牛微生態(tài)制劑中幾種益生茵生物學(xué)特性的研究［J］.畜牧與飼料科學(xué), 2006（5）：1-5.

［12］來航線, 楊保偉, 邱學(xué)禮, 等. 9株芽孢桿菌的初步分離與拮抗試驗［J］. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報, 2004（7）：93-96.