李曄 陳蕾 周君 李成華 蘇秀榕 李太武

浙江枝吻紐蟲（Dendrorhynchus zhejiangensis），屬于紐形動物門（Nematinea）、異紐目（Heteronemertea）、縱溝蟲科（Lineidae）、枝吻紐蟲屬（Dendro-rhynchus），最早在浙江省東部奉化市沿海的蝦塘中發(fā)現(xiàn)，因其獨特的分支狀的吻系統(tǒng)而得名［1，2］。紐蟲在進(jìn)化系統(tǒng)中，處于扁形動物和環(huán)節(jié)動物之間，具有完全的消化系統(tǒng)、初級的閉管式循環(huán)系統(tǒng)以及縱貫全身的發(fā)達(dá)的肌肉壁。另外，紐蟲具有受到刺激后吐出可再生的捕食器以及身體易斷裂、再生等特點。目前國內(nèi)外關(guān)于紐蟲的研究大多集中在新種的分類、形態(tài)解剖學(xué)、生理生化［1，3-6］、系統(tǒng)發(fā)育［7-9］。然而，在分子水平上對它的運動及再生的研究較少。有機(jī)體受損傷部分的愈合及再生過程依賴于細(xì)胞的運動，加強(qiáng)對細(xì)胞運動的了解，則有助于更深入地研究有機(jī)體的自我修復(fù)機(jī)制［10］。細(xì)胞運動是由于細(xì)胞骨架本身的聚合、解聚的相互協(xié)作，以及細(xì)胞不同部位與胞外基質(zhì)的黏附、解附的結(jié)果。肌動蛋白（actin）不僅是細(xì)胞骨架的主要組成成分，而且在細(xì)胞運動中起著重要的作用［11］。

肌動蛋白是由Bruno Straub于1941年在兔子的骨骼肌中發(fā)現(xiàn)并為其命名，在以后的研究中人們發(fā)現(xiàn)它是一類高度保守的蛋白質(zhì)，并普遍存在于真核生物中。1963年，Hanson和Lowy［12］提出了肌動蛋白單體（globular actin monomer，G-actin）以雙螺旋形式構(gòu)成肌動蛋白聚合體（filament actin，F(xiàn)-actin）的理論，這個理論極大地促進(jìn)了對肌動蛋白的研究。細(xì)胞中肌動蛋白常與其結(jié)合蛋白（actin binding proteins，ABPs）結(jié)合，以單體、寡聚體及聚合體形式存在，執(zhí)行不同的生理功能，聚合和非聚合形式的肌動蛋白在細(xì)胞中處于一種動態(tài)平衡。

F-actin是微絲的主要構(gòu)成成分。微絲進(jìn)一步參與細(xì)胞分裂、運動、遷移、形態(tài)的維持、生長等多種重要生理活動［13，14］，因此F-actin的生長動力學(xué)行為是細(xì)胞運動，胞質(zhì)分裂，以及細(xì)胞內(nèi)不同器官的運動基礎(chǔ)［15］。越來越多的研究表明肌動蛋白與更多的生物活動有關(guān)。例如，植物頂端生長，過氧化物酶體和線粒體的運動，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞內(nèi)吞作用等過程均有肌動蛋白的參與［16-18］。然而，肌動蛋白的聚合的動力學(xué)過程及其影響還沒有明確的定論。本試驗已克隆到了1830bp的actin的cDNA序列（GenBank：JN601113），該序列包含一個1131bp的ORF，編碼377個氨基酸，分子量約為41.816kD，包含了能與gelsolin、ATP和泛變應(yīng)原肌動蛋白抑制蛋白（profiling）相結(jié)合的結(jié)合位點［19］。

原子力顯微鏡（AFM）是一種能夠在生理條件下對生物大分子、活細(xì)胞表面以及細(xì)胞膜下結(jié)構(gòu)進(jìn)行體內(nèi)或離體研究的新型工具，具有原子級的成像分辨率和納米級的力測定功能。AFM能夠通過探針掃描待測樣品表面，記錄探針與樣品之間的作用力，獲取生物大分子（蛋白質(zhì)、核酸和多糖等）的分子構(gòu)象、功能及其相互關(guān)系的有用信息。

為了進(jìn)一步研究actin的結(jié)構(gòu)和功能，本研究進(jìn)一步對紐蟲actin進(jìn)行體外表達(dá)、純化及復(fù)性，并通過原子力顯微鏡觀察其體外自組裝情況。旨在為進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)及聚合的動力學(xué)過程，為找到相關(guān)疾病治療的作用靶點奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

浙江枝吻紐蟲采自浙江省東部奉化市湖頭渡（29.6oN，121.6oE）沿岸的蝦塘中，帶回實驗室在22℃下充氣養(yǎng)殖。原核表達(dá)載體pET-28a（+），大腸桿菌BL21（DE3）由本實驗室保存。QIAquick Gel Extraction購自QIAGEN公司，SDS-PAGE低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)、T4DNA連接酶、HindⅢ和BamHⅠ等均購自TaKaRa公司，ATP、Ni-NTA購自Invitrogen公司，actin標(biāo)準(zhǔn)品：actin from rabbit muscle購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 Actin的原核表達(dá)

1.2.1.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)已克隆到的actin的全長cDNA序列（GenBank：JN601113），設(shè)計包含限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ切點的引物（A-R’：5'-CGGGATCCATGTGTGACGACGAGAAT-3'和 A-F’：5'-CCCAAGCTTTTAGAAGCATTTCCTGTG-3'）擴(kuò)增得到紐蟲的actin的ORF序列。ORF擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)QIAquick Gel Extraction純化后，用BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切并插入到含互補(bǔ)酶切位點的原核表達(dá)載體pET-28a（+）中，獲得重組質(zhì)粒pET-28a-A。轉(zhuǎn)化E. coli DH5α后，經(jīng)陽性克隆篩選和PCR鑒定，重組克隆子送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。然后提取插入正確序列的重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到E. coli BL21（DE3）中。

1.2.1.2 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定的陽性重組細(xì)菌接種到LB培養(yǎng)液（含50μg/mL卡那霉素），37℃、120r/min振蕩培養(yǎng)至菌液A600值為0.6-0.8時加入IPTG使其終濃度為1mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)。在加入誘導(dǎo)劑后0、1、2、3、4、5、6h收集菌液1mL經(jīng)12000r/min離心5min，棄上清液4℃保存。樣品用40μL pH7.4的PBS懸浮細(xì)菌沉淀物，加入10μL的5×樣品緩沖液，水浴煮沸10min，通過SDS-PAGE電泳分離，考馬斯亮藍(lán)R-250染色檢測表達(dá)情況。

1.2.2 表達(dá)產(chǎn)物的純化及復(fù)性 收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌液，4℃、12000r/min離心5min，1×PBS漂洗后離心收集沉淀，加入1×PBS及溶菌酶，4℃反應(yīng)30min后超聲破碎，離心后收集胞質(zhì)中的可溶性物質(zhì)和包涵體沉淀，分別進(jìn)行12％ SDS-PAGE電泳分析。收集3mL菌液的包涵體沉淀，加入200μL Buffer B（100mmol/L NaH2PO4，10mmol/L Tris，6mol/L GuHCl，pH8.0），0.5μL β-巰基乙醇和 4μL 咪唑（終濃度為20mmol/L），輕微混勻后，在室溫放置1h，使包涵體充分溶解。4℃、12000r/min離心10min，上清置于新的離心管中備用。取50μL混合50％乙醇的Ni-NTA，輕微離心后，吸去上清，Ni-NTA用等量的Buffer B洗滌兩次。把包涵體破碎后的上清，加入到Ni-NTA中，室溫輕微混勻30min。4℃、12000r/min離心10s沉淀Ni-NTA，去上清。在Ni-NTA 中加入 250μL Buffer C（100mmol/L NaH2PO4，10mmol/L Tris，8mol/LUrea，pH6.3），和 5μL 咪唑（終濃度為20mmol/L），輕微混勻后，12000r/min離心10s，去上清，重復(fù)一次。加入25μL Buffer E（100mmol/L NaH2PO4，10mmol/L Tris，8mol/LUrea，pH4.5）， 和 5μL 咪 唑（終 濃 度 為 160mmol/L），12000r/min離心10s，上清為含重組蛋白的洗脫液E，重復(fù)3次。將含有8mol/L尿素的重組蛋白洗脫液放入透析袋中，于6mol/L尿素緩沖液（100mmol/L NaH2PO4，10mmol/L Tris，6mol/LUrea，pH 8.0），4℃透析過夜。于2mol/L尿素緩沖液（100mmol/L NaH2PO4，10mmol/L Tris，6mol/LUrea，pH8.0）中，4℃透析過夜。然后在復(fù)性Buffer（20mmol/L Tris，2mmol/L GSH，0.2mmol/L GSSG，5mmol/L EDTA，50mmol/L Glycine，10mmol/L ATP，1％蔗糖和0.1％PEG6000，pH8.0）中，4℃透析24h，并更換一次復(fù)性Buffer。于50mmol/L Tris-HCl緩沖液，4℃透析過夜以交換復(fù)性Buffer。SDS-PAGE分析鑒定表達(dá)產(chǎn)物的分離純化及復(fù)性情況。

1.2.3 Actin的體外自組裝 用F-緩沖液（5mmol/L Tris-Cl pH7.5，2mmol/L MgCl2，100mmol/L KCl，0.5mmol/L DTT，0.5mmol/L ATP）將 1mL純 化 復(fù) 性得到的r-actin精確稀釋至最終濃度為5μg/mL，取5μg/mL的actin標(biāo)準(zhǔn)品作為對照組，然后將試驗組及對照組樣品置于37℃恒溫箱中孵育0min、15min、30min及1h使其聚合。蛋白生長到預(yù)設(shè)的時間后，在新鮮剝離的云母表面（1cm×1cm）滴加4μL樣品，使蛋白能夠良好分散，沉降約5min后，置于干燥、潔凈的環(huán)境中自然晾干，用原子力顯微鏡（multimode scanning probe microscopy，NanoscopeⅢa，Veeco Instruments，USA）觀察，掃描所用探針型號為NSC11（三角形懸臂，MikroMash公司），其典型彈性常數(shù)為50N/m，典型共振頻率為330KHZ，掃描速率為1-1.2Hz。原子力顯微鏡采集的圖像保存為BMP格式，儲存在電腦中做進(jìn)一步的分析。上述所有操作均在超凈工作條件下進(jìn)行，以避免污染。

2 結(jié)果

2.1 Actin的原核表達(dá)

2.1.1 重組表達(dá)質(zhì)粒鑒定 重組質(zhì)粒pET-28a-A經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）顯示，出現(xiàn)了約4.5kb的pET-28a（+）載體DNA片段和約1.1 kb的插入片段，重組質(zhì)粒pET-28a-A轉(zhuǎn)化E.coli BL21后，挑取陽性克隆子測序后確定為目的片段。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-A的酶切鑒定結(jié)果

2.1.2 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，含重組質(zhì)粒的細(xì)菌在相對分子質(zhì)量44.3kD附近可見明顯的條帶，而未經(jīng)誘導(dǎo)菌株與空載體對照菌則無條帶。由于質(zhì)粒pET-28a（+）在多克隆位點上游有一段編碼序列，分子量約為3.5kD，而目的蛋白為41.816kD，故融合蛋白約為45kD，兩者相符。1mmol/L IPTG誘導(dǎo)后，目的蛋白隨著誘導(dǎo)時間的增加，表達(dá)量逐漸增多，4h時達(dá)到最大值，見圖2。

圖2 pET-28a-A重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析圖

2.2 表達(dá)產(chǎn)物的親和純化

將表達(dá)菌株超聲破碎，離心獲得的上清（胞質(zhì)中的可溶性物質(zhì)）和沉淀（包涵體沉淀）分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，該基因的表達(dá)產(chǎn)物主要以不可溶性的包涵體形式存在（圖3，泳道3）。進(jìn)一步利用GuHCl和β-巰基乙醇溶解包涵體后，Ni-NTA Agarose親和層析柱對r-actin進(jìn)行純化，收集洗脫液進(jìn)行12％ SDS-PAGE鑒定獲得的重組蛋白，采用該方法純化出的蛋白的得率約為100mg蛋白/250mL菌液。純化后的蛋白經(jīng)復(fù)性buffer處理后同樣經(jīng)12％ SDS-PAGE鑒定（圖3，泳道4，5）。

圖3 Actin 表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析及純化、復(fù)性后的SDSPAGE圖譜

2.3 R-actin的體外自組裝

經(jīng)純化復(fù)性后的r-actin蛋白在體外的自組裝過程通過激光原子力顯微鏡（AFM）被分析研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)性后的r-actin和actin標(biāo)準(zhǔn)品在37℃條件下，培養(yǎng)結(jié)果有較強(qiáng)的同源性。隨著培養(yǎng)時間的延長，兩種actin在體外通過自裝配過程除了形成無序的蛋白堆積物之外（圖4-A，B），均還能夠形成無規(guī)卷曲的纖維簇（圖4-C，D），以及具有不同直徑的長纖維等（圖4-E，F(xiàn)）。但是兩者在相同時間里達(dá)到的成熟度是不同的，r-actin培養(yǎng)30min后形成的無規(guī)卷曲的小纖維簇（圖4-C），而actin標(biāo)準(zhǔn)品在培養(yǎng)了30min后形成比較成熟的纖維（圖4-D），推測二者可能為聚合過程中不同階段的產(chǎn)物，具有不同的空間拓?fù)錁?gòu)象。培養(yǎng)60min以后，更大尺度上的復(fù)雜聚集結(jié)構(gòu)開始形成了，這種結(jié)構(gòu)可能由上述兩種纖維結(jié)構(gòu)通過分支纖維間的相互作用所形成。在這一階段，r-actin形成的是大量的，纖細(xì)的，彼此分離的纖維（圖4-E），而actin標(biāo)準(zhǔn)品則能夠形成多分枝的，具有較粗直徑的長纖維（圖4-F）。表明在沒有ABPs或F-actin穩(wěn)定劑存在的情況下，體外聚合的F-actin在一定條件下可進(jìn)一步聚集纏繞形成復(fù)雜的纖維結(jié)構(gòu)或無序的蛋白堆積物。

圖4 r-actin體外自組裝的AFM圖

3 討論

研究表明，浙江枝吻紐蟲actin基因?qū)儆讦令愋?，其cDNA全長為1830bp，包括167bp的5'非翻譯區(qū)，532bp的3'非翻譯區(qū)和1131bp的開放閱讀框。預(yù)測分子量為41.816kD，理論等電點5.30。其中氨基酸序列分析顯示actin序列中包含了能與gelsolin、ATP和泛變應(yīng)原肌動蛋白抑制蛋白（profiling）相結(jié)合的結(jié)合位點［19］。雙向電泳和Real-time PCR的結(jié)果顯示浙江枝吻紐蟲在斷裂前后，actin蛋白和actin mRNA的表達(dá)均發(fā)生了顯著的變化（結(jié)果未顯示）。推測actin在紐蟲的斷裂和再生過程中起了重要的作用。為了進(jìn)一步研究actin在紐蟲再生中的調(diào)控作用及其在體外聚合的動力學(xué)過程，本試驗將紐蟲actin基因進(jìn)行了原核表達(dá)，與來自兔肌肉的actin標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，分析它們體外聚合的不同特點。

在本試驗中，N端帶有6×His-tag的紐蟲actin的重組蛋白（r-actin）通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得，并通過Ni柱進(jìn)行了純化。由于r-actin的高表達(dá)，導(dǎo)致其在表達(dá)菌體中形成了難溶的、沒有生物活性的包涵體。為了進(jìn)一步研究r-actin的自裝配過程，溶解包涵體、除去變性劑、使重組蛋白再折疊成活性形式是關(guān)鍵步驟［20］。本試驗利用還原劑（β-巰基乙醇）打開二硫鍵，6mol/L GuHCl使蛋白質(zhì)變性，通過Ni柱純化得到變性的r-actin后，利用MaedeY設(shè)計的緩慢透析法進(jìn)行復(fù)性，8mol/L的尿素溶液作為起始透析液，然后逐漸稀釋透析液的尿素濃度，此種方法有助于減少蛋白質(zhì)在復(fù)性中產(chǎn)生的沉淀，提高活性蛋白收率［21，22］。采用谷胱甘肽氧化法促進(jìn)二硫鍵形成，即在復(fù)性液中加入低分子質(zhì)量的還原和氧化的含巰基的化合物提供合適的氧化還原電位，試驗表明，10∶1的還原型，氧化型的谷胱甘肽最有利于r-actin的復(fù)性。

在正常生理條件下，actin以兩種形式存在：單體球形的G-actin和非共價、雙螺旋、多聚體的F-actin，兩者在細(xì)胞內(nèi)通過聚合或解聚作用維持動態(tài)平衡，gelsolin等肌動蛋白結(jié)合蛋白則控制著這一動態(tài)過程，能在特定的時間、空間調(diào)節(jié)actin的聚合、解聚過程［23］。在體外簡單熱力學(xué)體系中，actin的自裝配為單純的、無干預(yù)的熱力學(xué)過程，完全受其內(nèi)在的熱力學(xué)特性所驅(qū)動，往往形成大尺度的聚集纖維結(jié)構(gòu)。其聚合動力學(xué)機(jī)制一般遵循非穩(wěn)態(tài)的踏車模型，并可分為4個步驟：肌動蛋白單體的活化；肌動蛋白單體聚合成核；肌動蛋白纖維生長的過程；聚合達(dá)到動態(tài)平衡，肌動蛋白纖維不再生長［24-26］。

在本試驗中，r-actin通過自裝配過程除了形成蛋白堆積物體系，起初形成了蛋白球，隨著培養(yǎng)時間的延長，還形成大量復(fù)雜的、離散細(xì)小的纖維結(jié)構(gòu)，這些纖維結(jié)構(gòu)分布比較分散，彼此間缺乏聯(lián)系。以單根成熟的F-actin形式存在的纖維很少，而且較短；相比之下，actin標(biāo)準(zhǔn)品在同樣條件下可長出較長的纖維，且一般直徑較粗，多有分支產(chǎn)生，但也很難找到由單根微絲組成的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。目前初步判斷，觀察到的高級結(jié)構(gòu)可能是由單根微絲通過非共價作用（氫鍵，范德華力和靜電作用等）進(jìn)一步形成的有序結(jié)構(gòu)；推測微絲間的相互纏繞或形成（多級）螺旋可能是高級纖維結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成方式。

與actin標(biāo)準(zhǔn)品相比，r-actin體外自組裝的進(jìn)程較緩慢的原因是由重組蛋白的純度和活性所決定的。雖然電泳的驗證r-actin經(jīng)純化后幾乎為單一條帶，但是即使溶液中存在少量的其他蛋白或離子均會對r-actin的自組裝行為產(chǎn)生影響。而重組蛋白的活性則是更大的影響因素，由于r-actin在原核表達(dá)過程中以包涵體的形式存在，必須經(jīng)過復(fù)性的步驟以恢復(fù)其正常的構(gòu)象，因而重組蛋白的活性不可能為100％。重組蛋白的體外自裝配過程是熱力學(xué)條件下的“自催化”聚合行為，無活性蛋白的存在勢必會干擾活性蛋白間的相互作用，從而影響聚合進(jìn)程。此外，試驗中的actin標(biāo)準(zhǔn)品來自于哺乳動物兔的肌肉，而r-actin則是來自于無脊椎動物紐蟲的，盡管沒有文獻(xiàn)報道不同生物間的actin的作用的差異，但也不能排除由于物種的差異，導(dǎo)致r-actin的聚合行為與標(biāo)準(zhǔn)品間存在一些不同。

盡管肌動蛋白的聚合過程已經(jīng)利用顯微鏡、原子力顯微鏡等進(jìn)行了研究，但是在非活性階段中，肌動蛋白單體發(fā)生了怎樣的變化仍然未知，由于儀器的分辨率及蛋白球生長過程易受多種因素的干擾，仍然觀察不到成核過程中中間體形成的過程［27］。調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合過程的因素應(yīng)構(gòu)成一個整體，不同環(huán)境中肌動蛋白的形態(tài)與其所處的環(huán)境之間具體有何種依賴關(guān)系也是今后的研究的重點，這些問題的解決將有利于了解肌動蛋白體外自裝配的過程，進(jìn)一步了解細(xì)胞運動及有機(jī)體的自我修復(fù)機(jī)制。

4 結(jié)論

重組蛋白（r-actin）在體外的自組裝過程量，其起初形成了蛋白球，隨著培養(yǎng)時間的延長，還形成大量復(fù)雜的、離散細(xì)小的弱纖維結(jié)構(gòu)，但彼此間缺乏聯(lián)系。來源于兔肌肉的actin標(biāo)準(zhǔn)品，在同樣條件下可生長為較為成熟的直徑較粗、多有分支的長纖維。纖維間也缺乏聯(lián)系，沒有形成交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。R-actin自裝配過程反映了其固有的聚合熱力學(xué)特性。

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