李鐵威 趙鵬飛 馬潔 阿拉坦高勒

人溶血磷脂酸受體1（LPAR1）是G-蛋白偶聯(lián)受體家族、EDG亞家族成員（EDG family）［1-3］，LPAR1在人體正常組織中普遍表達并可在溶血磷脂酸（Lysophosphatidic Acid，LPA）的誘導下與 Gi、Gq、G12/13偶聯(lián)介導諸多的細胞生理反應，如細胞增殖、分化、血小板凝集以及在腫瘤細胞中促進細胞的能動性、遷移等生物活性［4-8］。人的LPAR1基因位于人基因的9q31.3區(qū)，CDS區(qū)長1095bp，編碼364個氨基酸形成七次疏水跨膜蛋白結(jié)構(gòu)，分子量大約為 41kD［7，9-11］。LPAR1能夠感知細胞外LPA的刺激與Gi蛋白偶聯(lián)抑制cAMP的生成［9］。隨著對LPAR1介導的信號通路的深入研究發(fā)現(xiàn)，LPAR1可能參與細胞增殖與遷移及其相關(guān)疾病過程［3，12，13］。為進一步研究 LPAR1參與動脈硬化、腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展及遷移等問題，本研究克隆了LPAR1基因并構(gòu)建表達載體，瞬時轉(zhuǎn)染細胞，檢測細胞內(nèi)cAMP的積累，旨在為進一步研究溶血磷脂酸受體LPAR1的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗細胞及主要試劑 人胃癌細胞BGC803（本研究室保存）。限制性內(nèi)切酶 BamHⅠ、XhoⅠ、DNase及T4DNA連接酶（Thermo Scientific公司）；TranStart Taq DNA polymerase（北京全式金公司）；總RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒（上海生工生物有限公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；DMEM高糖（Gibco公司）；胰酶（Hyclone公司）；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000（Invitrigen公司）；DNA分子量標準（北京中科瑞泰公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）、實時定量試劑盒（北京康為世紀），pCR2.1載體（Invitrogen公司）；pIRES2-EGFP（Clontech）；293T細胞（本研究室保存），LPA（Sigma），ISP（Isoproterenol，異丙腎上腺素，Sigma），ELISA 試劑盒（AAT Bioquest），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器 PCR 儀為ABI公司產(chǎn)品，凝膠電泳儀和熒光定量PCR儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品，熒光倒置顯微鏡為尼康公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 LPAR1基因的克隆 從人胃癌細胞BGC-803提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物為模板，基因庫查找編碼人LPAR1的mRNA序列，用primer 5軟件設(shè)計引物，序列如下：上游引物P1：5'-CTCGAGATGGCTGCCATCTCTACTTC-3'，下游引物P2：5'-GGATCCCTAAACCACAGAGTGGTCATTG-3'（上海生工生物有限公司合成），其中下劃線為XhoⅠ和BamHⅠ酶切位點；擴增長度1107bp。PCR 反應體系 ：上游引物（10μmol/L）1.5μL，下游引物（10μmol/L）1.5μL，雙蒸水 31.5μL，10×GC Enhance 5μL，dNTPs（各 2.5mmol/L）4μL，10×TranStart Taq Buffer 5μL，TranStart Taq DNA polymerase 0.5μL，模板 1μL。反應條件 ：94℃預變性5min；94℃變性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 60s，30個循環(huán)；最后再于72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，純化回收 PCR產(chǎn)物，回收產(chǎn)物與pCR2.1載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，藍白斑篩選陽性（pCR2.1-LPAR1）克隆，送測序。

1.2.2 構(gòu)建表達載體 用XhoⅠ、BamHⅠ雙酶切pCR2.1-LPAR1與pIRES2-EGFP載體，酶切產(chǎn)物回收后用T4 DNA連接酶在16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆PCR鑒定，送測序。

1.2.3 瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞 293T細胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，胰酶消化制成單細胞懸液，以 2×105個/孔接種于6孔板。提取并純化pIRES2-EGFP-LPAR1和pIRES2-EGFP質(zhì)粒，用NanoDrop 核酸蛋白測定儀nd1000測定質(zhì)粒濃度和純度，分別轉(zhuǎn)染293T細胞。24h后觀察熒光照相，36h提取細胞總RNA。

1.2.4 實時定量PCR檢測目的基因的表達 收集未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染上述2種質(zhì)粒的293T細胞，用總RNA提取試劑盒提取各組細胞的總RNA，再用DNA酶Ⅰ去除RNA中可能殘余的基因組DNA，NanoDrop核酸蛋白測定儀nd1000檢測濃度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。GoldStar TaqMan Mixture 康為世紀試劑盒用來實時定量PCR檢測目的基因在各組細胞中的表達。所用引物如下：LPAR1基因檢測引物，上游引物：5'-CGTCAGGGCCTCATTGACA-3'，下游引物：5'-GTGCCTCTCGATTGCAATAGC-3'，LPAR1基因探針序列：5'-CCTGACGGCATCTGTGGCCAACTTA-3'；以GAPDH基因為內(nèi)參，上游引物：5'-CCAGGTGGTCTCCTCTGACTTC-3'，下游引物5'-GTGGTCGTTGAGGGCAATG-3'，GAPDH基因 探 針 序 列：5'-ACAGCGACACCCACTCCTCCACCTT-3'；反應體系：2×GoldStar TaqMan Mixture 25μL， 上 下 游 引 物（10μmol/L）各 1μL，探針（Probe）1μL，DNA 模板 2μL，RNase-Free Water 20μL，共 50μL。反應條件 ：95℃預變性10min；95℃變性15s，60℃（LPAR1）和60℃（GAPDH）退火1min，循環(huán)39次；每個反應有3次重復。

1.2.5 ELISA檢測LPA刺激下的cAMP含量 用ELISA試劑盒所給cAMP標準品制作標準曲線，LPA和ISP刺激轉(zhuǎn)染空載體（pIRES2-EGFP）和插入LPAR1基因載體（pIRES2-EGFP-LPAR1）的細胞4min然后用1mol/L HCl終止反應；裂解細胞收集胞內(nèi)cAMP。用ELISA試劑盒在熒光激發(fā)波長540nm和發(fā)射波長590nm處檢測LPA和ISP刺激下胞內(nèi)cAMP的積累量。

1.2.6 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計學軟件one-way ANOVA進行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果

2.1 LPAR1編碼區(qū)片段的克隆與序列測定

用引物P1、P2以 cDNA為模板擴增得到與預期片段大小相符的特異性片段（圖1）?；厥盏腜CR產(chǎn)物與pCR2.1載體連接成的重組質(zhì)粒pCR2.1-LPAR1經(jīng)酶切鑒定正確（圖2）。序列測定結(jié)果表明，擴增出的cDNA片段長1107bp，與已知的NCBI 基因庫中人LPAR1（NM_001401）序列完全一致。

圖1 LPAR1的PCR瓊脂糖電泳結(jié)果

圖2 pCR2.1-LPAR1酶切鑒定電泳結(jié)果

2.2 表達載體pIRES2-EGFP-LPAR1的構(gòu)建

獲得的重組質(zhì)粒pCR2.1-LPAR1和表達載體質(zhì)粒 pIRES2-EGFP 經(jīng) XhoⅠ+BamHⅠ雙酶切（圖 3），再將LPAR1（1107bp）片段與pIRES2-EGFP酶切產(chǎn)物連接，得到的表達載體pIRES2-EGFP-LPAR1，經(jīng)XhoⅠ+BamHⅠ雙酶切pIRES2-EGFP及pIRES2-EGFP-LPAR1鑒定與預期序列大小相符。

圖3 pIRES2-EGFP-LPAR1酶切鑒定電泳結(jié)果

2.3 轉(zhuǎn)LPAR1基因293T細胞檢測

pIRES2-EGFP-LPAR1 轉(zhuǎn)染293T細胞24h后觀察熒光（圖4），統(tǒng)計陽性細胞，轉(zhuǎn)染率約為61％。

圖4 轉(zhuǎn)染24h后觀察圖（100×）

2.4 實時定量PCR檢測LPAR1基因在293T細胞中的表達

LPAR1基因的表達檢測，分別提取未轉(zhuǎn)染細胞、轉(zhuǎn)染空載體（pIRES2-EGFP）的細胞和轉(zhuǎn)染插入LPAR1片段載體的細胞中總RNA并去除其中的基因組DNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以實時定量PCR法檢測LPAR1基因的表達，檢測到LPAR1基因表達水平顯著提高，與未轉(zhuǎn)染的細胞比較mRNA 表達提高71倍（圖5）。

圖5 pIRES2-EGFP-LPAR1轉(zhuǎn)染后的293T細胞中LPAR1基因相對表達量檢測

2.5 ELISA檢測轉(zhuǎn)基因細胞的cAMP含量

cAMP的檢測用10μmol/L LPA分別刺激轉(zhuǎn)染空載體（pIRES2-EGFP）的細胞和轉(zhuǎn)染插入LPAR1基因片段載體后的細胞并用1mol/L HCl終止反應，裂解細胞收集細胞裂解液，用ELISA試劑盒檢測cAMP的含量，檢測到轉(zhuǎn)染LPAR1基因的細胞cAMP降低（與轉(zhuǎn)染空載體的細胞比較）（圖6）。ISP（Isoproterenol，異丙腎上腺素）能夠刺激促進cAMP的產(chǎn)生，在1μmol/L ISP的存在下混以不同濃度的LPA刺激轉(zhuǎn)染LPAR1基因的細胞，檢測到胞內(nèi)cAMP的積累量隨著LPA濃度的升高而降低（圖7）。

圖6 LPA刺激轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-LPAR1后的293T細胞中cAMP表達量檢測

圖7 LPAR1轉(zhuǎn)基因細胞中不同濃度LPA刺激后cAMP含量檢測

3 討論

LPA是在血漿、血清、組織液及腦組織等體液與組織中廣泛存在的生理活性磷脂小分子［14］，在體內(nèi)有著廣泛的生物學作用，如，細胞增殖、細胞運動等；同時，LPA通過LPAR1與結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌、動脈粥樣硬化、神經(jīng)性疼痛等疾病密切相關(guān)［13，15-19］。LPA 通過 LPAR1偶聯(lián) Gi蛋白的信號通路抑制 cAMP 的產(chǎn)生［4，7，16］。為了詳細研究人溶血磷脂酸受體LPAR1的功能以及其介導的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路，本試驗克隆了人的LPAR1基因以及構(gòu)建真核表達載體質(zhì)粒pIRES2-EGFP-LPAR1，用脂質(zhì)體介導瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞，發(fā)現(xiàn)293T細胞具有極低量的LPAR1基礎(chǔ)表達。轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFPLPAR1后，293T細胞的LPAR1mRNA表達提高71倍（與未轉(zhuǎn)染的細胞比較）。通過檢測LPA刺激轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-LPAR1的細胞cAMP的含量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-LPAR1的細胞cAMP的含量低于轉(zhuǎn)染空載體（pIRES2-EGFP）的細胞，證實了該轉(zhuǎn)基因細胞成功表達了活性的LPAR1蛋白，能夠滿足于進一步的試驗需要。又通過在1μmol/L ISP（Isoproterenol）和濃度梯度的LPA共刺激LPAR1轉(zhuǎn)基因細胞發(fā)現(xiàn)LPA可以劑量依賴性的抑制cAMP的形成，且存在著線性關(guān)系。

本研究采用瞬時轉(zhuǎn)染LPAR1基因，獲得約為61％的轉(zhuǎn)染細胞，此時細胞基因表達相比未轉(zhuǎn)染的細胞便高出71倍，說明本試驗成功構(gòu)建得到LPAR1基因的真核表達質(zhì)粒；此外當細胞群中有61％的細胞高表達LPAR1時細胞應答所造成的差異便具有很高的顯著性，而實際當所有細胞均高表達LPAR1時所造成的差異應該比此更加明顯。Gerrard等［20］研究發(fā)現(xiàn)，在激活血小板的過程中檢測到多種分子形態(tài)的LPA分子，?；鶡N鏈的C原子數(shù)和脂肪酸的飽和度不同使LPA具有不同的分子結(jié)構(gòu)。隨后研究發(fā)現(xiàn)不同分子形態(tài)的LPA活化LPAR1受體的能力不同且在一定程度上存在著拮抗效應，其共同作用發(fā)揮其所介導的下游信號通路功能［21］，因此通過普通的方法檢測活化LPAR1受體的LPA濃度存在一定的難度，需要進一步的深入研究。

4 結(jié)論

克隆LPAR1基因并構(gòu)建LPAR1基因的真核表達質(zhì)粒pIRES2-EGFP-LPAR1，瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞獲得LPAR1轉(zhuǎn)基因細胞模型，LPAR1基因得以高表達。此外LPAR1被激活后能強烈抑制由ISP誘導的cAMP積累，其作用具有LPA劑量依賴性。

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