劉洋 孫佳帝

低溫是經(jīng)常發(fā)生且危害嚴重的逆境因素之一，許多果樹在經(jīng)受低溫脅迫后都發(fā)生不同程度的傷害，嚴重時甚至導(dǎo)致整個植株死亡。近年來，在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)的CBF（C- repeat/ dehydration responsive element binding factor）低溫反應(yīng)途徑，使當(dāng)前果樹抗寒基因工程研究取得了重大突破。CBF轉(zhuǎn)錄因子能夠特異結(jié)合啟動子中含有CRT/DRE 的順式元件，激活COR等基因的表達，從而提高植物的抗凍力［1，2］。本研究采用生物信息學(xué)方法對來自不同種屬的植物的低溫誘導(dǎo)基因CBF1的同源性進行分析，以此為基礎(chǔ)克隆山葡萄低溫誘導(dǎo)基因CBF1，并對該基因的核苷酸序列及氨基酸序列進行分析，旨在為下一步表達載體的構(gòu)建及基因轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院選育的兩性花山葡萄（Vitis amurensisRupr.）栽培品種“雙優(yōu)”。E.coli DH5α、表達質(zhì)粒pBI121由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院提供?？寺≥d體pMD18-T vector、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶及其他工具酶購自寶生物工程（大連）有限公司；DEPC、Tris等RNA提取試劑、植物基因組DNA小量提取試劑盒、切膠回收試劑盒、DNA清潔試劑盒、DNA Marker DL2000購自杭州維特潔生化技術(shù)公司。引物合成和測序由上海生工生物工程有限公司完成，序列測定用測序儀ABIPRISMTM377DNA Sequence進行。

1.2 方法

1.2.1 山葡萄葉片組織中總RNA的提取 以水培法培養(yǎng)山葡萄（Vitis amurensisRupr.）枝條，待枝條長出3-5片真葉時進行4℃低溫處理4h，采用CTAB法（操作方法參見《分子克隆實驗指南》第3版）提取山葡萄葉片組織總RNA。

1.2.2 山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因中間片段的分離

取 5μL（≤2μg）mRNA，2μL 反轉(zhuǎn)錄酶，4μL buffer（5×），2μL dNTP mix（10mmol/L），0.5μL RNase Ribonuclease Inhibitor，3.5μL DEPC 水，70℃ 水浴變性5min，冰浴5min稍離心，慢慢混勻后，低速離心，收集液滴，42℃溫浴60min，85℃加熱10min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，得到cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增，20μL的體系包括0.5μL cDNA，2μL buffer（10×），2μL Mg2+（25mmol/L），0.25μL dNTP（10mmol/L），0.5μL P1，0.5μL P2，0.25μL Taq 酶（5U/μL），14μL ddH2O，擴增引物見表 1。擴增程序如下：95℃溫育15min后，進入熱循環(huán)，第 1 個循環(huán)參數(shù)為 94℃ 45s，68℃ 30s，72℃ 30s，此后每個循環(huán)的退火溫度下降1℃，共計9 個循環(huán)，然后以94℃ 45s，56℃→ 61℃ 30s，72℃30 s梯度PCR 方式運行35個循環(huán)，72℃延伸8min 結(jié)束。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳回收后連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在Amp平板上挑取重組質(zhì)粒，PCR鑒定后送至大連寶生物工程公司進行測序。

1.2.3 反向PCR方法分離山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因側(cè)翼序列 根據(jù)1.2.2分離出來的CBF1基因中間片段，設(shè)計兩對特異引物（ViCBF1-F1、 ViCBF1-R1及ViCBF1-F2、ViCBF1-R2），見表1。用植物基因組DNA小量提取試劑盒（見說明書）提取山葡萄基因組DNA，應(yīng)用一種在已知序列及側(cè)翼的未知區(qū)域中沒有酶切位點的限制性內(nèi)切酶HindⅢ消化，消化體系 40μL，包括HindⅢ（30U）2μL，Buffer（10×）4μL，BSA（0.1％）4μL，DNA 20μL（1.5μg），dd-H2O 10μL，65℃處理18-20min，滅活內(nèi)在的限制性內(nèi)切酶。純化回收DNA樣品（用DNA清潔試劑盒），具體操作方法按照說明書進行，利用回收的DNA樣品作為反向PCR的模板，進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠中電泳分離，回收目的片段進行克隆測序。

1.2.4 山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因全長DNA及cDNA的克隆 根據(jù)方法2.3得到的山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因的側(cè)翼序列，在其側(cè)翼序列設(shè)計一對特異引物（ViCBF1-F3 、ViCBF1-R3），見表 1。以山葡萄基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠中電泳分離，回收目的片段進行克隆測序。

在ViCBF1基因的ORF設(shè)計一對特異引物（ViCBF1-F4 、ViCBF1-R4）（表 1）。以反轉(zhuǎn)錄 cDNA為模板進行RT-PCR擴增，獲得山葡萄CBF1基因的全長cDNA 序列。

表1 克隆CBF1基因所用引物

1.2.5 山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因的序列分析 山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因序列相似性比較在http：//ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站上用BLAST進行，根據(jù)目的基因核苷酸序列用Primer 5.0軟件推導(dǎo)出目的基因的氨基酸序列，并進行序列分析。

2 結(jié)果

2.1 山葡萄總RNA的提取與mRNA的分離

山葡萄植物細胞中含酚類化合物，并且多糖含量比較高，為此在本試驗在CTAB原方法的基礎(chǔ)上增加PVP（聚乙烯吡咯烷酮）含量，因為PVP中的CO-N=基有很強的結(jié)合多酚化合物的能力，能有效地去除多酚對RNA提取的干擾，從而獲得純度較高的山葡萄RNA，如圖1所示，23S 核糖體RNA 與18S核糖體RNA 的帶型清晰銳利，它們的亮度比基本上呈2∶1 關(guān)系，不存在蛋白質(zhì)、多糖和酚類物質(zhì)的明顯干擾。

2.2 山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因中間片段及側(cè)翼序列的獲得

以mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進行電泳，通過PCR獲得cDNA的擴增片段，將擴增產(chǎn)物重組到pMD18-T克隆載體上進行測序，測序結(jié)果為758bp。根據(jù)序列信息，設(shè)計兩對側(cè)翼序列嵌套引物，反向PCR獲得一長度約為750bp的片段（圖2）；測序結(jié)果為753bp（圖3）所示，其中有546bp是與上述已經(jīng)分離出來目的基因中間片段的重疊區(qū)域（圖3中的陰影部分即是）。圖3中的方框部分是新擴增出來的片段，長度為206bp，雙下劃線部分的6bp是HindⅢ酶切位點，HindⅢ的實際酶切位點是AAGCTT，而在本試驗中由于此酶產(chǎn)生了星號活性，此位點變?yōu)锳TGCTT（雙下劃線），剩余的200bp新擴增出來的片段，其中有94bp是目的基因的5'端片段（即方框中雙下劃線右側(cè)序列，106bp目的基因的3'端片段（即方框中雙下劃線左側(cè)序列）。

圖1 4℃低溫處理4h山葡萄的RNA的提取

圖2 RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

圖3 反向PCR測序結(jié)果

2.3 山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因全長DNA及 cDNA的克隆

以山葡萄基因組DNA為模板，引物ViCBF1-F3、ViCBF1-R3（表1）。進行PCR擴增，得到的PCR產(chǎn)物比較特異，無雜帶，無降解現(xiàn)象（圖4）。以山葡萄mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進行電泳，引物ViCBF1-F4、ViCBF1-R4（表1），PCR獲得cDNA的擴增片段，如圖5所示。測序結(jié)果所得到的序列與我們用基因組擴增所得到的序列在編碼區(qū)內(nèi)完全一致，這說明山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因在編碼區(qū)內(nèi)沒有內(nèi)含子。與所報道的其他植物中CBF1基因在編碼區(qū)內(nèi)沒有內(nèi)含子的結(jié)論完全一致。過程受此區(qū)域的控制。位于C末端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)酸性氨基酸含量較高，位于第237-251個氨基酸之間，其pI在3.6-3.9之間，這一區(qū)域在轉(zhuǎn)錄激活中起主要作用。

圖4 目的基因全長的PCR分析

圖5 目的基因的cDNA克隆的PCR產(chǎn)物

2.4 山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列分析

山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因序列全長為910bp，編碼區(qū)長為753bp，無內(nèi)含子。山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因的核苷酸序列及推測的氨基酸序列，如圖6所示。CBF1轉(zhuǎn)錄因子屬于AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子，其一級結(jié)構(gòu)中含有AP2 DNA結(jié)合域（圖6中的陰影部分），它由79個氨基酸殘基組成，在不同的植物中非常保守，山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因與其他幾種植物中的CBF1基因的同源性主要歸因于它們的AP2 DNA結(jié)合域的高度同源。預(yù)測的堿性核定位信號位于N末端區(qū)域，位于第36-75個氨基酸之間，富含精氨酸和賴氨酸，CBF1轉(zhuǎn)錄因子進入細胞核的

圖6 山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1的核苷酸序列及其相應(yīng)的氨基酸序列

2.5 山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因的氨基酸序列分析

根據(jù)開放閱讀框的密碼子翻譯，推測該基因編碼一個含有251個氨基酸的多肽，分子量約為27.503kD，等電點偏低，pI=3.11，屬酸性蛋白。

表2 氨基酸成分組成成分

通過氨基酸組成分析得知，山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因中絲氨酸的濃度較高，達到13.55％，而堿性氨基酸賴氨酸和精氨酸的濃度分別為6.37％和6.77％，酸性氨基酸谷氨酸和天冬氨酸的濃度分別為5.58％和6.77％（表2）。

2.6 山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因氨基酸序列比較

Blast軟件分析表明，山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因與其他幾種植物的CBF1有著很高的相似性，其中與茄科辣椒屬中的簇生椒（Capsicum annuum）、鹽芥（Thellungiella salsuginea）、橡膠樹（Heavea brasiliensis）、葡萄（Vitis vinifera）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）蘋果（Malus×domestica）、大麥（Hordeum vulquare）、馬藺（Iris lactea var. chinensis）等植物的CBF1基因的氨基酸同源性達到80.7％。如圖7所示，在不同植物中AP2/EREBP區(qū)域內(nèi)是高度保守的，它含有1個由約60-70個氨基酸殘基組成的非常保守的DNA結(jié)合域（DNA-binding domain），主要功能是調(diào)節(jié)低溫、干旱、高鹽等脅迫條件下的應(yīng)答反應(yīng)。而且在AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域的上游和下游分別有兩段保守序列，即PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR，在預(yù)測由擬南芥編碼產(chǎn)生的140多種 AP2/EREBP域蛋白中，只有CBF1、CBF2和CBF3才具有這兩段短多肽序列，因而稱其為CBF蛋白的特征序列，而在AP2/EREBP區(qū)域的兩側(cè)氨基酸序列總體上看沒有明顯的同源性。

圖7 十種植物低溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因的氨基酸序列比較

3 討論

近 3年來，在擬南芥［3］、油菜［3］、水稻［4］和番茄［5］等植物中發(fā)現(xiàn)了CBF1轉(zhuǎn)錄激活因子，本研究采用生物信息學(xué)方法對所能獲得的低溫誘導(dǎo)植物的CBF1基因序列進行了系統(tǒng)分析，進而獲得了不同低溫誘導(dǎo)植物的CBF1基因的共同結(jié)構(gòu)域，藉此合成兼并引物，并以山葡萄葉片組織為材料，采用RT-PCR和反向PCR技術(shù)成功獲得了山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因，在GenBank上的登錄號為DQ517296，并采用Blast軟件分析對大麥（Hordeum vulquare）、水稻（Oryza sativa）等10種低溫誘導(dǎo)植物的CBF1基因的氨基端序列進行了比對，其同源性達到80.7％，這也說明基因進化的保守性。該研究的核心技術(shù)在于：兼并引物的設(shè)計及兼并引物條件下PCR條件的設(shè)置。該方法與慣常使用的同源序列法的不同點在于以大量低溫誘導(dǎo)植物的CBF1基因的相似性為基礎(chǔ)，采用梯度PCR方法，無須要求引物序列的完全匹配，對同源性的要求較低。此外，本研究采用反向PCR的方法一次性獲得目的基因的側(cè)翼序列即非編碼區(qū)部分，該方法只需要提取基因組DNA進行單酶切和自身環(huán)化，從而簡化了分離未知基因的步驟。

比較分析現(xiàn)有的低溫誘導(dǎo)的植物CBF1基因序列發(fā)現(xiàn)，CBF1基因中含有高度保守的AP2/EREBP結(jié) 構(gòu) 域［6，7］，AP2/EREBP 家 族 的 轉(zhuǎn) 錄 因 子 是 與環(huán)境脅迫應(yīng)答反應(yīng)等有關(guān)的一系列轉(zhuǎn)錄因子。在山葡萄AP2/EREBP域的上游和下游存在PKK/RPAGRxKFxETRH和DSAWR特征序列，在擬南芥［8］編碼產(chǎn)生的140多種AP2/EREBP域蛋白中，只有CBF1、CBF2、CBF3才具有這兩段短多肽序列，兩序列在進化程度不同的物種［9，10］中保守存在。因此，推測這兩段序列為CBF蛋白的特征序列，在CBF基因抗寒性功能研究中發(fā)揮非常重要的作用。結(jié)合本研究的結(jié)果及CBF1同源基因研究方面的文獻，可以推測這樣一種可能：即存在一種和CBF 蛋白相似的蛋白質(zhì)與編碼去飽和酶的基因的啟動子中某一元件結(jié)合，促進編碼去飽和酶的基因的表達，去飽和酶使膜脂的不飽和度增加，從而最終增加膜脂在低溫條件下的流動性和穩(wěn)定性，增強植物的抗寒力。

4 結(jié)論

本研究設(shè)計了一對兼并引物，采用RT-PCR及反向PCR技術(shù)克隆了山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因全長，其ORF長為753bp，無內(nèi)含子。經(jīng)序列比較分析，該基因?qū)儆贏P2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子，其一級結(jié)構(gòu)中含有AP2DNA結(jié)合域，它由79個氨基酸殘基組成，在不同的植物中較保守。

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