代文娟 駱文華 馬虎生 符支宏，2 唐文秀 趙博 盤波 黃仕訓(xùn)

廣西火桐（Erythropsis kwangsiensis）為梧桐科、火桐屬（Erythropsis）植物，中國特有種，僅分布于廣西中部至南部的石灰?guī)r地區(qū)，對研究植物區(qū)系和植物地理及親緣關(guān)系等均有重要的學術(shù)價值。野生資源量極少，具有重要的經(jīng)濟價值和科研價值，為國家二級重點保護植物［1］。

簡單序列重復(fù)區(qū)間（Inter-simple sequence repeat，ISSR）是一種基于SSR的簡單重復(fù)序列區(qū)間擴增多態(tài)性分子標記［2］，它結(jié)合了SSR和RAPD的優(yōu)點，主要特點是操作簡單，遺傳多態(tài)性高，重復(fù)性好，耗資少，模板DNA用量少。因此，ISSR標記技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性的研究［3-6］。

目前，尚未見利用ISSR對廣西火桐進行遺傳分析的報道。為了確保ISSR分析結(jié)果的可靠性和重復(fù)性，對ISSR-PCR反應(yīng)體系進行優(yōu)化非常必要。本試驗利用正交設(shè)計對廣西火桐ISSR-PCR反應(yīng)中的MgCl2濃度、dNTPs濃度、Taq DNA聚合酶濃度、模板DNA濃度進行系統(tǒng)的研究，并探討退火溫度和反應(yīng)循環(huán)次數(shù)對ISSR-PCR的影響，以期建立穩(wěn)定且重復(fù)性好的廣西火桐ISSR-PCR反應(yīng)體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 廣西火桐材料取自廣西植物研究所內(nèi)10 株成年植株的當年生嫩葉。

1.1.2 試 劑 Buffer、MgCl2、dNTPs、Taq DNA 聚合酶等均購于上海生物工程有限公司，ISSR引物由上海生物工程有限公司合成；經(jīng)初步篩選將引物U835［（Ag）8YC］作為此次正交試驗的引物。

1.2 方法

1.2.1 總DNA的提取 利用植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）（上海捷瑞生物工程有限公司）進行DNA的提取，操作步驟參照說明。

1.2.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交試驗設(shè)計與PCR擴增采用 L16（44）正交試驗設(shè)計，對 MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶、模板DNA進行4因素4水平篩選，方案如表1所示。表中共有16個處理，每個處理做2個重復(fù)，共32管，按表中的數(shù)據(jù)加樣。在Biometra TProfessional PCR儀（華粵企業(yè)集團有限公司）上進行擴增。反應(yīng)體系為25μL，除表中所列因素外，每管還有1× PCR buffer。根據(jù)文獻資料［7，8］，初步確定 ISSR-PCR 擴增程序為 ：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，50℃退火45s，72℃延伸1.5min，共35個循環(huán)；72℃最后延伸7min。擴增后的PCR產(chǎn)物在4℃保存。

表1 ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交試驗設(shè)計［L16（44）］

1.2.3 溫度梯度PCR 在PCR梯度擴增儀上設(shè)置最小退火溫度為45℃，最大為60℃，PCR儀自動形成8個梯度，即45℃、45.9℃、48℃、50.8℃、54.5℃、57.5℃、59.1℃、60℃每個梯度設(shè)3次重復(fù)。PCR反應(yīng)體系根據(jù)正交試驗的結(jié)果而定，擴增程序除退火溫度外，其余同1.2.2。

1.2.4 循環(huán)次數(shù)的確定 設(shè)置25、30、35、40、45這5個不同循環(huán)次數(shù)，PCR反應(yīng)體系和擴增程序中的退火溫度分別根據(jù)正交試驗和溫度梯度PCR試驗結(jié)果而定，其余同1.2.2。

1.2.5 ISSR-PCR產(chǎn)物的檢測 擴增反應(yīng)結(jié)束后，10μL上樣液含1μL GelGreen核酸染料在1％瓊脂糖凝膠中電泳60min，電壓設(shè)定為120V，于生物電泳圖像分析系統(tǒng)（美國UVP）成像分析系統(tǒng)拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 正交設(shè)計的結(jié)果

2.1.1 各因素對PCR反應(yīng)影響的差異 L16（44）正交設(shè)計的試驗和PCR擴增結(jié)果，見圖1。根據(jù)電泳條帶數(shù)、亮度和背景對每個處理進行評分，并將結(jié)果計入表1中。圖1顯示第9、14和15組條帶明亮、背景清晰、數(shù)量較多。其余組合或沒有條帶，或條帶較暗、數(shù)量少，或背景模糊。因此，第9、14、15組的評分較高，第1、2、4組的評分較低。對重復(fù)處理的PCR電泳結(jié)果評分2計入表1，其結(jié)果與第1次PCR擴增結(jié)果高度一致。對16個處理評分結(jié)果進行極差分析，各因素對反應(yīng)體系的影響從大到小依次為MgCl2、模板DNA、Taq DNA聚合酶、dNTPs（表2）；各個因素的最佳反應(yīng)水平分別為：MgCl2為第4個水平，dNTPs為第3個水平，Taq DNA聚合酶為第3個水平，模板DNA為第2個水平。最佳組合為MgCl2為2.5mmol/L，dNTPs為0.2mmol/L，Taq DNA 聚合酶為 0.06U/μL，模板 DNA為3ng/μL。但這一組合在正交表中并沒有出現(xiàn)，與分值較高的兩個組合（第14組和第15組）較接近。

圖1 ISSR-PCR正交試驗結(jié)果

表2 ISSR-PCR正交試驗結(jié)果極差分析

為了彌補極差分析的缺陷，用DPS 9.50統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行了方差分析。結(jié)果（表3）顯示，各因素對廣西火桐ISSR-PCR反應(yīng)的影響程度從大到小依次為：MgCl2、TaqDNA聚合酶、模板DNA、dNTPs。其中，模板DNA濃度、dNTPs對結(jié)果的影響未達到顯著水平；Taq DNA聚合酶對結(jié)果的影響都達到了顯著水平，MgCl2對結(jié)果的影響都達到了極顯著水平，所以還應(yīng)對MgCl2和Taq DNA聚合酶進行水平間的多重比較。

表3 ISSR-PCR正交試驗結(jié)果方差分析

2.1.2 各因素不同水平間多重比較 隨著MgCl2濃度從1.0-2.5mmol/L增加，擴增結(jié)果均值由小變大，當增加到2.5mmol/L時均值最大（圖2），且與其他3個水平之間差異均達到極顯著水平。因此，MgCl2最佳濃度為2.5mmol/L。

圖2MgCl2濃度與評分結(jié)果均值的關(guān)系

dNTPs濃度從0.1-0.25mmol/L（圖3），擴增結(jié)果均值沒有規(guī)律變化，在0.20mmol/L時均值最大，且與其他3 個水平之間的差異達到極顯著水平。

TaqDNA聚合酶濃度從0.02-0.08U/μL，擴增結(jié)果均值先增大后減小，在0.06U/μL時均值最高，0.02U/μL時均值最低（圖4），且與其他3個水平之間的差異均達到極顯著水平。

隨著DNA模板濃度增大（圖5），擴增結(jié)果均值無規(guī)律變化，當濃度為2ng/μL時均值最低，為3ng/μL時均值最高，且與其他3個水平之間差異達到極顯著水平。

2.2 退火溫度的確定

圖6中，各個退火溫度均能擴增出產(chǎn)物，且背景清晰。但若退火溫度過低，特異性差，有些主帶不明顯，見圖6中的泳道1（45℃）、泳道2（45.9℃）、泳道3（48℃）；退火溫度過高，引物與模板的特異性增強，造成多態(tài)性偏低，擴增產(chǎn)物較少或譜帶亮度相對較弱，如圖6 中的泳道6（57.5℃）、泳道7（59.1℃）、泳道8（60℃）；合適的退火溫度，即泳道4（50.8℃）和泳道5（54.5℃）擴增產(chǎn)物多態(tài)性高，條帶清晰明亮，背景清晰。故本試驗以52℃為ISSR-PCR擴增的最佳退火溫度。

圖3 dNTPs濃度與評分結(jié)果均值的關(guān)系

圖4 Taq DNA聚合酶濃度與評分結(jié)果均值的關(guān)系

圖5 DNA模板濃度與評分結(jié)果均值的關(guān)系

2.3 循環(huán)次數(shù)的確定

根據(jù)正交試驗結(jié)果所得的最佳反應(yīng)體系，在最適退火溫度下，對PCR循環(huán)數(shù)進行梯度試驗，設(shè)置5 個梯度，結(jié)果如圖7所示。當循環(huán)次數(shù)為30時能得到清晰穩(wěn)定且豐富的條帶，而其他循環(huán)次數(shù)的擴增產(chǎn)物有所減少，背景模糊，有些條帶較弱甚難辨讀。因此，30個循環(huán)是該反應(yīng)體系的最佳循環(huán)次數(shù)。

圖6 溫度梯度PCR電泳圖（UBC857）

圖7 循環(huán)次數(shù)試驗

2.4 ISSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定性

用UBC835引物對10份廣西火桐DNA用優(yōu)化后ISSR-PCR體系及擴增程序進行擴增，結(jié)果顯示（圖8），擴增譜帶明亮，背景清晰，穩(wěn)定性好，多態(tài)性豐富，表明該反應(yīng)體系和反應(yīng)程序穩(wěn)定性、重復(fù)性較好，適合于廣西火桐進行ISSR-PCR反應(yīng)。

圖8 引物U835在10份廣西火桐樣品中的ISSR擴增結(jié)果

3 討論

影響ISSR反應(yīng)體系的因素包括MgCl2濃度、dNTPs濃度、Taq DNA聚合酶濃度等。研究表明，MgCl2濃度對PCR反應(yīng)影響較大，不僅影響Taq DNA聚合酶的活性，也影響 PCR 產(chǎn)物的解鏈溫度、產(chǎn)物的特異性、模板與引物的結(jié)合等［9］。過量的MgCl2會導(dǎo)致酶催化非特異性產(chǎn)物的擴增，而濃度過低，又使酶的催化活性降低。本試驗中，MgCl2濃度為2.5mmol/L時擴增效果最佳。dNTPs作為PCR反應(yīng)的原料，濃度太低會使擴增反應(yīng)不完全，從而降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量；濃度過高會對MgCl2產(chǎn)生抑制作用，影響Taq DNA酶活力，造成浪費［10］。試驗結(jié)果顯示，dNTPs濃度為0.2mmol/L時，擴增得到的條帶數(shù)量和質(zhì)量均較理想。Taq DNA聚合酶濃度過高或過低都會影響擴增的結(jié)果。本試驗中，0.06U/μL的Taq DNA聚合酶濃度最佳。PCR反應(yīng)對模板DNA用量要求的范圍通常較廣，在60-100ng內(nèi)均可獲得較好的擴增效果［11，12］。但為避免DNA中雜質(zhì)對試驗的影響，應(yīng)盡可能采用較低的模板濃度進行擴增。因此，本試驗中的DNA用量為3ng/μL。綜合以上分析和經(jīng)濟因素，選擇第14組合作為廣西火桐ISSR-PCR反應(yīng)的最佳體系。

引物的理論退火溫度（Tm值）和通過試驗選出的最適退火溫度并無明顯規(guī)律性［13，14］，試驗結(jié)果支持這一觀點。本試驗中選用引物U835的理論退火溫度為56℃， 但試驗結(jié)果顯示52℃是最佳退火溫度。

循環(huán)次數(shù)決定產(chǎn)量，循環(huán)次數(shù)偏少，產(chǎn)物擴增不完全，條帶不明亮；循環(huán)次數(shù)偏多，錯配幾率增加，非特異性產(chǎn)物增多，條帶易彌散。此外，循環(huán)次數(shù)還受各反應(yīng)成分的用量限制。通過試驗，廣西火桐ISSR-PCR反應(yīng)的最佳循環(huán)次數(shù)為30。

4 結(jié)論

廣西火桐的ISSR-PCR反應(yīng)體系最佳擴增反應(yīng)條 件 為 ：25μL 體 系 中 1×PCR buffer，2.5mmol/L MgCl2，0.15mmol/L dNTPs，0.06U/μL Taq DNA 聚合酶，3ng/μL DNA模板，0.2μmol/L引物。適合廣西火桐的最佳擴增程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性 45s，52℃退火45s，72℃延伸 1.5min，共30個循環(huán)；72℃最后延伸7min。

［1］國家林業(yè)總局, 農(nóng)業(yè)部.國家重點保護野生植物名錄（第一批）［J］.植物雜志 , 1999（5）：4-11.

［2］Zietkiewicz E, Rafslski A, Labuda D. Genome Fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification［J］. Genomics, 1994, 20：176-183.

［3］張杰, 吳迪, 汪春蕾, 等.應(yīng)用ISSR-PCR分析蒙古櫟種群的遺傳多樣性［J］.生物多樣性, 2007, 15（3）：292-299.

［4］彭云滔, 唐紹清, 李伯林, 等.野生羅漢果遺傳多樣性的ISSR分析［J］.生物多樣性, 2005, 13（1）：36-42.

［5］賓曉蕓, 唐紹清, 周俊亞, 等.金花茶遺傳多樣性的ISSR分析［J］.武漢植物學研究, 2005, 23（1）：20-26.

［6］周俊亞, 唐紹清, 向悟生, 等.栽培羅漢果遺傳多樣性的ISSR分析［J］.廣西植物 , 2005, 25（5）：431-436.

［7］代文娟, 唐文秀, 鄧濤, 等.正交設(shè)計優(yōu)化狹葉坡壘ISSR-PCR反應(yīng)體系［J］. 中國農(nóng)學通報, 2011, 27（18）：143-147.

［8］張永夏, 劉曉, 黎科, 等.珍稀植物楊葉肖槿ISSR體系建立及檢測［J］.西北植物學報, 2012, 32（4）：829-834.

［9］史云峰, 禹利君, 劉仲華, 等.皺邊石杉內(nèi)生真菌 ISSR-PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化［J］. 湖南農(nóng)業(yè)大學學報：自然科學版, 2012,38（4）：398-403.

［10］張龍進, 白成科.正交設(shè)計優(yōu)化北重樓ISSR-PCR體系［J］.植物研究, 2011, 31（1）：105-108.

［11］李元春, 沈林, 等.山核桃SRAP體系的建立及與RAPD和ISSR標記的比較［J］.浙江農(nóng)林大學學報, 2011, 28（3）：505-512.

［12］胡甦, 王永清, 陶煉.三角紫葉酢漿草ISSR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化［J］.草業(yè)學報, 2011, 20（5）：142-150.

［13］Pissard A, Ghislain M, Bertin P. Genetic diversity of the Andean tuber-bearing species, oca（Oxalis tuberoseMol.）, investigated by inter-simple sequence repeats［J］.Genome, 2006, 49（1）：8-16.

［14］付燕, 羅楠, 楊芩, 等.枇杷屬植物ISSR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化［J］.果樹學報, 2009, 26（2）：167-172.