馬明月，張磊，張玉敏，裴秀叢，段志文

(1．沈陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110034；2．大連市疾病預(yù)防控制中心)

過氧化物酶體增殖因子激活受體(peroxisome proliferator activated receptors，PPARγ)是核受體超家族成員，在糖類代謝、脂肪酸氧化以及脂肪細(xì)胞分化方面有著重要作用[1]。同時，在細(xì)胞分化、發(fā)育中有重要作用[2-3]。生殖器官中由特定的配體激活后，PPARγ的調(diào)節(jié)功能通過調(diào)節(jié)類固醇合成酶的表達(dá)能力。各種內(nèi)源性因素，如花生酸、脂肪酸和前列腺素代謝產(chǎn)物，可作為PPARγ的天然配體。有些環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，如鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)及其活性中間產(chǎn)物MEHP作為外源性過氧化物酶體增殖劑，在其致生殖毒性中的作用已引起關(guān)注[4-5]。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)是目前最有效的基因功能研究手段之一。慢病毒siRNA表達(dá)載體的成功構(gòu)建使RNAi 技術(shù)邁上了新的臺階[6]。研究發(fā)現(xiàn)在類固醇合成過程中，睪丸Leydig細(xì)胞具有激素分泌功能，且其生成機(jī)制均與PPARγ有關(guān)[7]，故本研究選擇小鼠Leydig細(xì)胞株TM3，構(gòu)建特異靶向小鼠PPARγ基因的RNAi慢病毒載體，建立使用PPARγ基因穩(wěn)定沉默的Leydig細(xì)胞株，旨在為研究PPARγ在生殖毒性研究中的功能提供新的實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3、慢病毒包裝細(xì)胞，人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞(購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)，常規(guī)培養(yǎng)使用含10% FBS (Gibco)的DMEM/F12培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基(Gibco)(含1.5 mM L-Glutamine，100 U/ml penicillin，100 μg/ml Streptomycin)中，37 ℃ 5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 針對PPARγ基因的慢病毒載體構(gòu)建和慢病毒包裝 針對Genebank中小鼠PPARγ基因設(shè)計的干擾序列，見表1。實驗所用慢病毒包裝由生工生物工程(上海)公司提供服務(wù)。

表1 siRNA序列

寡核苷酸的設(shè)計及表達(dá)shRNA的慢病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建：LV3-shRNA模板中的loop結(jié)構(gòu)選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號。正義鏈模板的5′端添加了GATCC，與BamH I酶切后形成的粘端互補(bǔ)；反義鏈模板的5′端添加了AATTC，與EcoR I酶切后形成的粘端互補(bǔ)。

根據(jù)確定的PPARγ基因RNAi 有效序列sh-PPARγ及對照序列sh-Control，化學(xué)合成對應(yīng)的寡核苷酸DNA單鏈，退火形成粘性末端的DNA雙鏈，運用基因克隆技術(shù)，與經(jīng)雙酶切后的穿梭質(zhì)粒連接。

1.3 慢病毒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

1.3.1 慢病毒滴度檢測 293T細(xì)胞在6 cm細(xì)胞培養(yǎng)中培養(yǎng)至80%～90%融合時，傾去培養(yǎng)液，用3 ml D-Hank′s液洗滌細(xì)胞2次。加入1 ml Trypsin-EDTA 液，混勻后，小心棄去胰酶溶液，37 ℃放置3～5 min。再加入2 ml 含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，吹打使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞稀釋至3×105個/ml，按3×104個/孔的濃度接種96孔板，混勻后于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h。將慢病毒原液(10～20 μl)，用10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液10倍稀釋3～5個梯度(根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，如有必要可加入終濃度為5 μg/ml的 Polybrene)。吸去96孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入100 μl稀釋的病毒液，同時設(shè)立空白對照組，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h。吸棄96孔板中的稀釋病毒液，每孔加入150 μl 10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液(根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，如有必要可分出1/3～1/5)于37 ℃ 5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)48、72 h。通過熒光顯微鏡計數(shù)熒光細(xì)胞，結(jié)合稀釋倍數(shù)計算病毒滴度(實驗過程中注意生物安全要求)。

1.3.2 靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗 TM3細(xì)胞在10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至80%～90%融合時，傾去培養(yǎng)液，用2 ml D-Hank’s液洗滌細(xì)胞2次。加入1 ml Trypsin-EDTA液，混勻后，37 ℃放置2～3 min。小心棄去胰酶溶液，再加入2 ml 含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，吹打使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液。血球計數(shù)板計數(shù)，按1×105個/孔的濃度接種96孔板，混勻后于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h。將慢病毒原液200 μl，用10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液5倍稀釋(根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)及類型，如有必要可加入終濃度為5 μg/ml的 Polybrene)。吸去96孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入上述100 μl稀釋的病毒液，同時設(shè)立空白對照組，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h。吸棄96孔板中的稀釋病毒液，每孔加入200 μl 10% FBS的DMEM/F12培液(根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，如有必要可分出1/3～1/5) 于37 ℃ 5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)72、96 h，分別收樣，所得細(xì)胞用于mRNA及Western blot檢測。

1.4 Real-time PCR 檢測 病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后，制備實驗組、對照組、未處理組細(xì)胞cDNA，使用QIAGEN公司RNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)染篩選后的細(xì)胞RNA及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。取上述總RNA 1 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，具體方法同我們之前的研究[8]，引物對序列由本室設(shè)計，生工生物工程(上海)公司合成(表2)。根據(jù)Real-time PCR相對定量2-△△CT方法，計算目的基因的相對表達(dá)，重復(fù)3次。

表2 引物序列

1.5 Western blot 檢測 轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒后，收集各組細(xì)胞，每個細(xì)胞樣本加入100 μl 細(xì)胞裂解液，使組織完全裂解。裂解物移入離心管中。取5 μl 樣本加入5 μl 2×SDS-PAGE上樣緩沖液(loading buffer)，100 ℃加熱處理5 min，冰上冷卻。12 000 g 離心10 min去除不溶性沉淀。樣品使用10% SDS-PAGE分離，每孔上樣量為20 μl。電泳結(jié)束后，將PVDF膜在甲醇中浸泡1 min，再使用轉(zhuǎn)移緩沖液(transfer buffer)浸泡凝膠、濾紙和在甲醇中浸泡過的PVDF膜10 min，然后制備轉(zhuǎn)移三明治。使用Semi-Dry Cell 進(jìn)行半干電泳轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移條件為30 mA 70 min。用1×Ponseau 液染色并標(biāo)記蛋白質(zhì)Marker的條帶位置。使用Blocking Buffer 封閉轉(zhuǎn)印膜2 h，然后用1×TBST 洗滌3 次，每次10 min。加入適當(dāng)稀釋的一抗，4 ℃溫育過夜。用1×TBST 洗滌3 次，每次15 min。加入適當(dāng)稀釋的二抗，室溫溫育2 h。用1×TBST 洗滌3 次，每次15 min。用Super Signal West Pico Chemiluminent Substrates進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測，并對X光片曝光。經(jīng)顯影定影處理后，膠片用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，分析圖像，比較各組間PPARγ蛋白的相對表達(dá)量。重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 特異靶向小鼠PPARγ基因的RNA干擾慢病毒載體LV3-sh-PPARγ構(gòu)建成功 測序結(jié)果，如圖1。直接測序結(jié)果顯示表明，重建的穿梭質(zhì)里包含sh-PPARγ序列，說明成功構(gòu)建包含PPARγ-sh-RNA的新的慢病毒載體，命名為LV3-sh-PPARγ。由圖1可見，靶序列1087、1089、1091構(gòu)建成功；靶序列1092堿基豐度不夠，且出現(xiàn)錯誤序列。

圖1 靶序列(1087、1088、1091、1092)及對照序列(NC)的測序結(jié)果

2.2 病毒包裝產(chǎn)生有效滴度的病毒液轉(zhuǎn)導(dǎo)TM3細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高 慢病毒濃縮成1 ml后，取10 μl按照1∶10侵染293T細(xì)胞，以檢測包裝病毒滴度情況。轉(zhuǎn)染72 h后，用熒光顯微鏡觀測293T細(xì)胞的GFP，以估計侵染效率，四種靶序列及對照序列的慢病毒載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞效率高。滴度合適即可進(jìn)行下步轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗。經(jīng)計算，病毒的滴度為5×108TU/ml。轉(zhuǎn)染72 h后，用熒光顯微鏡觀測細(xì)胞的GFP，具有RNAi效應(yīng)的細(xì)胞(1087、1088、1091、1092)轉(zhuǎn)染效率>90%。

2.3 LV3-sh-PPARγ能有效降低PPARγ基因在Leydig細(xì)胞TM3中的表達(dá) 轉(zhuǎn)導(dǎo)后，Real-Time PCR相對定量結(jié)果，見圖2。實驗組(1087、1088、1091、1092)TM3細(xì)胞PPARγ的mRNA的表達(dá)比未處理細(xì)胞下降70%(P<0.05)，對照組與未處理細(xì)胞差異無顯著性(P>0.05)。Western blot 顯示實驗組(1087、1088、1091、1092)PPARγ蛋白表達(dá)量比未處理細(xì)胞明顯下降(P<0.05)，對照組與未處理細(xì)胞差異無顯著性(P>0.05)。LV3-sh-PPARγ對于內(nèi)參GAPDH無影響。見圖3、4。

*與未處理細(xì)胞(Blank)組比較，P<0.05圖2 轉(zhuǎn)導(dǎo)72 h后 PPARγ mRNA相對表達(dá)水平

1：樣本1087；2：樣本1088；3：樣本1091；4：樣本1092；5：NC；6：Blank圖3 TM3細(xì)胞中PPARγ的蛋白表達(dá)水平(GAPDH作為內(nèi)參照)

*與未處理細(xì)胞(Blank)組比較，P<0.05圖4 TM3細(xì)胞中PPARγ蛋白相對表達(dá)量(GAPDH作為內(nèi)參照)

2.4 PPARγ穩(wěn)定沉默的小鼠Leydig細(xì)胞株TM3構(gòu)建成功 轉(zhuǎn)導(dǎo)慢病毒后的TM3細(xì)胞熒光陽性率達(dá)到90%以上，通過分揀陽性轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)LV3-sh-PPARγ以及LV3-Control兩個細(xì)胞株，分揀后的細(xì)胞熒光陽性率達(dá)100%。繼續(xù)培養(yǎng)分揀后細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長至最佳狀態(tài)后，收集并凍存細(xì)胞，保存于-150 ℃。這樣PPARγ基因穩(wěn)定敲低的Leydig細(xì)胞株TM3及其對照細(xì)胞株TM3構(gòu)建成功。

3 討論

構(gòu)建穩(wěn)定干擾PPARγ基因的細(xì)胞株是人們關(guān)注的焦點，目前對于PPARγ在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中扮演的角色仍然存在著很大的爭議。構(gòu)建穩(wěn)定干擾PPARγ基因的細(xì)胞株，進(jìn)而揭示PPARγ在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的確切功能，不僅能幫助闡明睪酮分泌機(jī)制，并且能開拓基因治療的一條嶄新途徑，PPARγ將可能成為極好的藥物潛在治療靶點[9]。慢病毒介導(dǎo)RNAi載體的研究與其他基因功能研究技術(shù)相比，RNAi具有明顯優(yōu)勢。RNAi的抑制效率遠(yuǎn)高于反義核苷酸及核酶技術(shù)，并且作用更穩(wěn)定，采用表達(dá)載體可使作用更持久[10]。本研究構(gòu)建了四個靶序列從基因測序結(jié)果、mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)檢測結(jié)果來看，靶序列1088的效果較好。本研究第1次采用慢病毒介導(dǎo)RNAi技術(shù)構(gòu)建特異靶向PPARγ基因的慢病毒RNA干擾系統(tǒng)，并構(gòu)建PPARγ穩(wěn)定敲低的人睪丸間質(zhì)細(xì)胞株，為該基因功能的研究成功地構(gòu)建了有效的細(xì)胞模型，也為相關(guān)的基因治療開辟了嶄新的前景。

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