尹靜文， 吳貴華，王杏林

(1.天津醫(yī)科大學(xué)，天津　300070；　2.天津市藥品檢驗(yàn)所，天津　3000070；　3.天津藥物研究院，天津　300193)

得生片由益母草、柴胡、當(dāng)歸、川芎、白芍、木香6味藥材組成，具有調(diào)經(jīng)養(yǎng)血，理氣化瘀之功效。處方中白芍可養(yǎng)血柔肝，芍藥苷是白芍的主要有效成分之一。采用HPLC測(cè)定得生片中芍藥苷含量的方法可用于得生片質(zhì)量控制，并可對(duì)生產(chǎn)中使用的白芍藥材質(zhì)量提供客觀評(píng)價(jià)。

1　儀器與試藥

日本SHIMADZU LC-20AD高效液相色譜儀，二極管陣列檢測(cè)器，LC solution工作站。芍藥苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110736-201035)，得生片(天津某藥品生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)，批號(hào)1008003、 1004001、1006002)。甲醇(色譜純，天津市康科德科技有限公司)，磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀(分析純，華東試劑廠)。水為去離子水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱為Agilent -C18(250 mm×4.6 mm，5 μm); 以甲醇-0.1%磷酸緩沖鹽(pH為7.4) (21∶79)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，柱溫：40 ℃ ；流速：1 ml/min。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

2.2溶液制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1 ml含40 μg的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備取裝量差異項(xiàng)下的樣品，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，精密加入70%甲醇25 ml，稱定重量，超聲處理60 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，搖勻，即得。

2.2.3陰性樣品溶液的制備按處方取除白芍的各味藥材，按制法制得片劑樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，制得陰性樣品溶液。

2.3陰性對(duì)照試驗(yàn)分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀中，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析。結(jié)果陰性樣品在芍藥苷色譜峰對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

1.芍藥苷

2.4線性關(guān)系考查分別精密移取“2.2.1”項(xiàng)下芍藥苷對(duì)照品溶液15、25、50、、75和100 μl至50 ml量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄色譜圖和峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，求得回歸方程：Y=1.377 767×106X+8.793×103(r=0.9999)。結(jié)果表明芍藥苷在0.120 78～1.0065 μg范圍內(nèi)線性良好。

2.5進(jìn)樣精密度試驗(yàn)取同一批(批號(hào)1008003)樣品，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定樣品中芍藥苷峰面積，峰面積的RSD為0.67%，符合要求。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)取同一批(批號(hào)1008003)樣品，共6份，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，測(cè)定每份樣品中芍藥苷含量。結(jié)果表明樣品中芍藥苷平均含量為1.5688 mg/g，RSD為1.4%，符合要求。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批(批號(hào)1008003)樣品，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，分別在0、3、6、9、12和15 h測(cè)定樣品中芍藥苷峰面積，測(cè)得峰面積值的RSD為 0.67%，符合要求。

2.8回收率試驗(yàn)取同一批(批號(hào)1008003)樣品，研細(xì)，取約0.5 g，共6份，精密稱定，置錐形瓶中，分別精密加入芍藥苷對(duì)照品70%甲醇溶液(0.040 26 mg/ml)20 ml，精密加入70%甲醇5 ml，再按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，制得供回收率用供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，計(jì)算回收率，結(jié)果顯示平均回收率為101.9%，RSD為1.30%，符合規(guī)定。見(jiàn)表1。

表1　加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.9樣品含量測(cè)定取3個(gè)批號(hào)的樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定樣品中芍藥苷含量。結(jié)果分別為1.6465、1.5925和1.5805 mg/g(n=2)。

3　討論

3.1流動(dòng)相的選擇高效液相法測(cè)定芍藥苷含量時(shí)，在《中國(guó)藥典》等現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[1]中采用有多種流動(dòng)相系統(tǒng)。試驗(yàn)中對(duì)甲醇-水(25∶75)、乙腈-水(15∶85)、乙腈-冰醋酸-水(16∶1∶8)及甲醇-0.1%磷酸緩沖鹽(pH為7.4)(21∶79)等進(jìn)行選擇。前3種流動(dòng)相，存在多種問(wèn)題，尤其是為克服雜質(zhì)干擾，芍藥苷色譜峰出峰保留時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，色譜峰拖尾嚴(yán)重，對(duì)測(cè)定結(jié)果有一定影響。根據(jù)試驗(yàn)選擇了甲醇-0.1%磷酸緩沖鹽(pH為7.4)(21∶79)作為本方法的流動(dòng)相，其效果較好，色譜峰不拖尾，可達(dá)到基線分離，分離度符合要求。

3.2提取方法的選擇

3.2.1提取溶劑 取同一批(批號(hào)1008003)樣品，研細(xì)，取約1 g 3份，精密稱定，分別精密加入甲醇、70%甲醇和50%甲醇各25 ml，稱定重量，超聲處理60 min，放冷，再稱定重量，用各自的溶劑補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，分別測(cè)定樣品中芍藥苷含量。結(jié)果表明，用甲醇提取的結(jié)果含量較低，為1.1398 mg/g，以50%、70%甲醇提取結(jié)果為1.5939 mg/g，RSD(%)僅為0.53%，無(wú)顯著差別。采用低濃度甲醇，在試驗(yàn)操作中難于過(guò)濾，試驗(yàn)誤差也較大。上述試驗(yàn)用70%甲醇提取的結(jié)果含量最高，試驗(yàn)操作便利，故本試驗(yàn)采用70%甲醇為提取溶劑。

3.2.2提取方式取同一批(批號(hào)1008003)樣品，研細(xì)，取約1 g 4份，精密稱定，精密加入70%甲醇25 ml，稱定重量，分別超聲處理或加熱回流60 min，放冷，稱定各自重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，測(cè)定樣品中芍藥苷含量分別為1.5954和1.5750 mg/g(n=2)。4份測(cè)定結(jié)果RSD為0.65%，說(shuō)明采用超聲處理和加熱回流兩種提取方式，測(cè)定結(jié)果基本相同。但超聲處理較簡(jiǎn)便，故選擇超聲處理為樣品的提取方式。

3.2.3提取時(shí)間取同一批(批號(hào)1008003)樣品，研細(xì)，取約1 g 8份，精密稱定，分別精密加入70%甲醇25 ml，稱定重量，分別超聲處理30、45、60或90 min，放冷，再稱定各自重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失各自的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，測(cè)定樣品中芍藥苷的含量分別為1.5678、1.5723、1.5929和1.5688 mg/g(n=2)，RSD為0.6%。測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯區(qū)別，但超聲60 min提取的結(jié)果含量最高，故選定超聲處理時(shí)間為60 min。

3.3耐用性試驗(yàn)取重現(xiàn)性試驗(yàn)中5、6號(hào)樣品溶液，使用日本SHIMADZU LC-2010AD高效液相色譜儀，二極管陣列檢測(cè)器，LC solution工作站。分別使用 Diamonsil - C18，(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，Sepax Sappire C18，(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱和Agilent -C18，(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，測(cè)定樣品中芍藥苷含量。結(jié)果表明采用3種不同色譜柱測(cè)定結(jié)果分別為1.5867、1.5855和1.5826 mg/g，RSD為0.34%，無(wú)顯著性差異，表明該含量測(cè)定方法耐受性良好，具有可行性。

1中國(guó)藥典[S].一部.2010：95-96