杜穎華，葉存喜，馬景學，韓 瑤，張 斌，包永琴，郝玉華

增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)是一種嚴重的致盲性眼病，有較高的復發(fā)率，治療效果一直不理想[1]。視網(wǎng)膜色素上皮細胞(RPE)是PVR發(fā)生過程中最重要的細胞[2-3]。姜黃素是近年來國內(nèi)外關注的一種天然藥物，可以抗腫瘤、抗纖維化、抗炎、抗菌、抗氧化等，且毒性低[4-15]。細胞內(nèi)傳導中，胞內(nèi)游離鈣離子(Ca2+)作為重要的第二信使參與信息傳遞，其濃度的變化調節(jié)著細胞的代謝、基因表達。而整合素家族是介導細胞與細胞外基質以及細胞間黏附的重要黏附分子家族，它們能誘導細胞的活化、增生、運動和凋亡，在生物體的發(fā)育、器官形成、血管新生、炎癥反應和創(chuàng)傷愈合等過程中發(fā)揮重要作用。安建斌等[16]用不同濃度的姜黃素處理傳代培養(yǎng)的兔RPE，結果顯示姜黃素可明顯抑制其上皮細胞增殖。姜黃素是否可以抑制人RPE的增殖，對細胞內(nèi)傳導信號和細胞外基質有何影響，國內(nèi)外少有報道。為此我科在體外培養(yǎng)人RPE細胞，姜黃素干預后，利用MTT篩選合適的濃度，激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)觀察早期細胞內(nèi)鈣離子的熒光強度，實時定量PCR檢測整合素的相應變化，探討相關性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 Ham′s F12培養(yǎng)液(英國Biochrom公司)；胎牛血清(FBS)、小鼠抗人角蛋白AE1/AE3、小鼠抗人S-100抗體(武漢博士徳生物工程有限公司)；L-谷氨酰胺、胰蛋白酶(上海實生生物技術有限公司)；NaCl溶液(上海國藥集團化學試劑有限公司)；0.0625 g/L青霉素、100 g/L鏈霉素(石家莊華北制藥有限公司)；CO2細胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；培養(yǎng)皿(美國Corning公司)；二甲基亞砜(DMSO)、四氮唑化合物(MTT)(美國Sigma公司)；倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)；激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)；Trizol(美國Invitrogen公司)；Realplex2熒光定量PCR儀(德國Eppendorf公司)；姜黃素(美國ALEXIS公司，純度≥98.5%)；羊抗小鼠的IgG(美國 Cell Signal Technology公司)。

1.2 細胞培養(yǎng) 原代人RPE細胞購自武漢原生原代公司，捐獻者無已知的眼部疾病。人RPE細胞的傳代培養(yǎng)參照以前的文獻[17]。培養(yǎng)液采用Dulbecco改良的Ham′s F12培養(yǎng)基，含10%的胎牛血清，4 mM谷氨酸，100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素；當細胞貼壁增殖后，在37 ℃，采用含有0.125%胰蛋白酶的乙二胺四乙酸(EDTA)的混合溶液消化5 min。細胞用Ham′s F12液洗滌并以4×104個/ml密度接種培養(yǎng)。原代培養(yǎng)達到融合后，細胞用含胰蛋白酶的EDTA溶液消化，計數(shù)，稀釋1∶2或1∶4后，再次接種做再次培養(yǎng)。RPE細胞通常每周傳代，在37 ℃，體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。日常于倒置顯微鏡下觀察RPE的生長狀態(tài)，并照相。取接種于6孔板半融合狀態(tài)的第二代細胞做鑒定。經(jīng)4%多聚甲醛固定20 min，做角蛋白和S-100的免疫熒光鑒定。一抗為小鼠抗人角蛋白AE1/AE3、對應使用的二抗為FITC(綠色熒光)標記的羊抗小鼠的IgG；還有小鼠抗人S-100的一抗、對應使用的二抗為TRITC(紅色熒光)標記的羊抗小鼠的IgG。第2代至第4代的傳代細胞用于實驗。

1.3 MTT比色法檢測不同濃度的姜黃素作用下對RPE細胞增殖的抑制作用 選取對數(shù)生長期的RPE細胞以1×105個/孔密度接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)12 h后棄去培養(yǎng)液，加入含有不同濃度姜黃素的細胞培養(yǎng)液100 μl。濃度分組為：空白對照組、0.9375、1.8750、3.7500、7.5000、15.0000 mg/L姜黃素組。每組設12個復孔。分別培養(yǎng)48 h后，離心5 min，每孔加20 μl MTT(5 mg/ml)，37 ℃溫箱中孵育4 h，倒置顯微鏡下可見活細胞內(nèi)生成大量顆粒、針狀formazan結晶。棄去培養(yǎng)液，每孔加入10%DMSO 150 μl，置搖床上低速震蕩10 min，觀察到formazan結晶完全溶解后，用酶標儀檢測490 nm處各孔吸光度〔A，舊稱光密度(OD)〕值，以僅加有100 μl DMSO的同板孔做空白對照。細胞增生抑制率=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%，實驗共重復3次。

1.4 LSCM觀察不同濃度的姜黃素作用下對RPE細胞內(nèi)早期鈣離子的變化 取傳至第4代呈對數(shù)生長的RPE細胞以1×105個/ml密度接種于35 mm玻底培養(yǎng)皿(載玻片的厚度為20 mm)，培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)，用D-hanks′液洗2次后用含終濃度為5 μmol/L fluo-3AM的D-hanks′液在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中負載30 min，熒光染色后，每只培養(yǎng)皿再用D-hanks′液洗去未負載的探針，姜黃素分別以0.9375、1.8750、3.7500、7.5000、15.0000 mg/L濃度干預人RPE細胞，立即上機檢測，觀察RPE細胞內(nèi)熒光強度和細胞內(nèi)游離Ca2+濃度變化。熒光顯微鏡采集熒光圖像(各參數(shù)均調為手動，設置統(tǒng)一曝光值、光圈大小、對比度、白平衡)用于定量RPE細胞內(nèi)鈣離子的熒光強度。用Photoshop cs 5軟件打開待分析圖像，針對陽性信號區(qū)域進行手動框取，記錄灰度值。

1.5 實時定量(Real-Time)PCR測定整合素基因的表達 取傳至第6代呈對數(shù)生長的RPE細胞以1×106個/ml密度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)，加3.75 mg/L姜黃素干預組為實驗組，不加藥組為空白對照組，分別孵育48 h后收集。采用Trizol一步法提取總RNA；DNaseⅠ消化RNA樣品，去除其中可能含有的基因組DNA，無RNA酶的水將經(jīng)過DNaseⅠ消化的RNA樣品純化稀釋后，進行RNA質量檢測，采用紫外吸收分光光度計測定260、280 nm處吸光度值，以A260/A280比值評價其純度并推算RNA濃度，比值范圍1.8～2.1；變性瓊脂糖凝膠電泳法測定RNA的完整性；冰上操作反轉錄合成cDNA；冰上配制熒光定量RT-PCR反應混合液(2× SuperArray PCR master mix 550 μl，已稀釋的cDNA 102 μl，ddH2O 448 μl)，上PCR儀進行聚合酶激活/變性95 ℃，10 min，擴增40個循環(huán)95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，收集熒光。每組的每個基因重復檢測3次。經(jīng)內(nèi)參照β-肌動蛋白(β-actin)基因均一化處理后，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

2 結果

2.1 RPE細胞培養(yǎng)及鑒定 原代培養(yǎng)的細胞經(jīng)過2 d適應期后，在鏡下可見到活性的RPE細胞貼壁，開始伸出偽足，呈扁平不規(guī)則多角形，胞漿內(nèi)富含黑色素顆粒，可見清晰透明的圓形單核或雙核細胞。細胞貼壁后便開始分裂繁殖，呈鑲嵌式排列，5～7 d后細胞基本融合成單層。RPE細胞表達S-100抗原和角蛋白AE1/AE3，葡萄膜的色素細胞只表達S-100抗原但不表達角蛋白，而成纖維細胞兩者都不表達[18]，以此可以鑒別。

2.2 不同濃度姜黃素對RPE細胞增殖的抑制作用 空白對照組和0.9375、1.8750、3.7500、7.5000、15.0000 mg/L各個濃度的姜黃素組作用于RPE細胞48 h后，MTT法測得的姜黃素對RPE細胞的抑制率分別為〔0、(-0.07±0.10)、(-0.03±0.06)、(0.78±0.02)、(0.80±0.10)、(0.83±0.06)〕(F=10556.53，P<0.05)。0.9375和1.8750 mg/L組與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(F=1.045，1.028；P>0.05)。而3.75、7.5和15 mg/L姜黃素組與空白對照組相比，對RPE細胞增殖的均有抑制作用(q=21.899，24.086，27.102；P<0.05)。與空白對照組相比，MTT法分析姜黃素作用RPE細胞48 h的IC50為4.436 mg/L(見圖1A～1F)。

2.3 LSCM測得姜黃素干預早期RPE細胞內(nèi)鈣離子熒光強度變化 采用Photoshop cs 5軟件分析空白對照組和0.9375、1.8750、3.7500、7.5000、15.0000 mg/L各個濃度的姜黃素組作用于RPE細胞后，早期細胞內(nèi)鈣離子熒光表達量的變化?？瞻讓φ战M，0.9375、1.8750、3.7500、7.5000、15.0000 mg/L姜黃素組中鈣離子熒光強度的表達經(jīng)統(tǒng)計學分析后顯示，RPE細胞經(jīng)不同濃度姜黃素干預后早期，鈣離子的熒光強度與姜黃素干預的濃度呈正相關(r=0.922，P<0.05，見圖2A-2F，圖3)。

2.4 實時定量PCR測得整合素基因的表達 實時定量PCR反應檢測的目的基因分別為整合素α1、整合素α2、整合素α3、整合素α4、整合素α5、整合素α6、整合素α7、整合素α8、整合素αL、整合素αM、整合素υ、整合素β1、整合素β2、整合素β3、整合素β4和整合素β5共16個基因，與空白對照組比較，有統(tǒng)計學差異的整合素α3、整合素α4、整合素α5和整合素β5，P值分別為0.0165、0.0062、0.0226和0.004 (t值分別為-2.164、-3.135、-1.056、-4.296)，較對照組基因表達量呈正效應的是整合素α4和整合素β5，負效應的是整合素α3和整合素α5。

圖3 不同濃度姜黃素刺激RPE細胞后，早期Ca2+的熒光灰度值與姜黃素的濃度呈正相關(0=空白對照組；1=0.9375 mg/L姜黃素組；2=1.8750 mg/L姜黃素組；3=3.7500 mg/L姜黃素組；4=7.5000 mg/L姜黃素組；5=15.0000 mg/L姜黃素組)

Figure3 After treatment of various concentration curcumin groups，there were positive relationship and dose-dependent between the fluorescence frequency of calcium ion and the different concentration curcumin groups(0，1，2，3，4 and 5 represented respectively=blank control group，0.9375，1.8750，3.7500，7.5000，15.0000 mg/L curcumin groups)

圖1A～1F 依次為空白對照組48 h RPE細胞，0.9375、1.8750、3.7500、7.5000、15.0000 mg/L姜黃素作用RPE細胞48 h倒置顯微鏡照片

Figure1A～1FIn turn：the blank control group 48 h RPE cell，0.9375，1.8750，3.7500，7.5000，15.000 mg/L the effect of curcumin on RPE cells of 48 h inverted microscope photos

圖2A～2F 依次為空白對照組負載鈣離子探針的RPE細胞，0.9375、1.8750、3.7500、7.5000、15.0000 mg/L姜黃素作用負載鈣離子探針的RPE細胞熒光顯微鏡照片

Figure2A～2FIn turn：blank control group load of calcium ion probe RPE cells，0.9375，1.8750，3.7500，7.5000，15.000 mg/L the effect of curcumin on load of calcium ion probe RPE cell fluorescence microscope

3 討論

Ca2+作為胞內(nèi)重要的第二信使，是生存與死亡的信號，幾乎所有的生理活動都受到Ca2+的調控。在靜息狀態(tài)下，一般細胞外Ca2+濃度為1.8 mmol/L，胞內(nèi)游離鈣離子濃度〔(Ca2+)i〕維持很低的水平，僅為0.1 μmol/L，而當細胞受到外界信號刺激時，(Ca2+)i能迅速增加100倍以上，以介導各種生物學效應。但若胞內(nèi)(Ca2+)i持續(xù)過高，則對細胞有毒性作用[19]。有研究表明，鈣與細胞凋亡關系密切，主要表現(xiàn)為細胞內(nèi)鈣超載可以誘發(fā)凋亡，而阻止細胞內(nèi)鈣離子濃度升高可以抑制凋亡。這一現(xiàn)象最早在胸腺細胞中被揭示，隨后在淋巴細胞、骨髓細胞、心肌細胞及神經(jīng)細胞中也得到證實[20-21]。McConkey[22-24]認為胞漿Ca2+升高通過兩條途徑誘導細胞凋亡，一是胞外Ca2+內(nèi)流促使胞漿Ca2+持續(xù)升高，作為凋亡信號啟動細胞凋亡；二是Ca2+的釋放打破了細胞內(nèi)結構的穩(wěn)定，使得細胞凋亡效應系統(tǒng)的關鍵成分與其細胞外基質異常的交互作用，從而觸發(fā)細胞凋亡。目前，對細胞內(nèi)鈣超載通過激活下游鈣依賴的凋亡相關激酶(如鈣蛋白酶、鈣調磷酸酶及核酸內(nèi)切酶-1)誘發(fā)凋亡和通過改變線粒體膜的通透性來實現(xiàn)的機制已經(jīng)有了較明確的闡述。但是對于細胞外基質的機制近年來越來越受到關注。整合素家族是介導細胞與細胞外基質以及細胞間黏附的重要黏附分子家族，它們能誘導細胞的活化、增殖、運動和凋亡，在免疫調節(jié)、腫瘤浸潤、損傷修復中等過程中發(fā)揮重要作用。大量的實驗表明當整合素與細胞外基質結合后，可激活多條細胞內(nèi)的信號轉導途徑。其中包括：啟動細胞內(nèi)Ca2+的轉移，使細胞內(nèi)Ca2+濃度增高。已證明整合素所致的Ca2+轉移為白細胞的遷移所必需，整合素的活性也受來自細胞內(nèi)信號的調節(jié)。整合素胞外部分是纖維連接蛋白(FN)、玻璃黏連蛋白(VN)、層黏連蛋白(LN)、骨橋蛋白(OPN)、纖維蛋白原(Fibrinogen)、膠原蛋白(collagen)等細胞外基質受體，參與增殖、分化、生存、凋亡、形態(tài)維持和動力等相關的細胞信號；整合素細胞內(nèi)結構通過和細胞骨架連接蛋白，如：激動蛋白(α-actin)、細絲蛋白(filamin)、踝蛋白(talin)、張力蛋白(tensin)、樁蛋白(paxillin)、紐蛋白(vinculin)；信號激活蛋白，如：Ser/Thr蛋白激酶、整合素連接激酶(ILK)，非受體酪氨酸激酶；黏著斑激酶(FAK)、Syk，Ca2+離子結合蛋白(calreticulin)等信號通路蛋白相互作用，形成蛋白復合體黏附點結構。細胞外刺激、細胞內(nèi)結構和功能變化通過整合素有機整合，構成信息由內(nèi)向外和由外向內(nèi)雙向傳遞的渠道[25-26]。

MTT法分析姜黃素作用RPE細胞48 h的IC50為4.436 mg/L。形態(tài)學上顯示3.7500 mg/L濃度以上的姜黃素作用RPE細胞48 h后，對RPE細胞的抑制作用明顯。LSCM觀察到0.9375、1.8750、3.7500、7.5000、15.0000 mg/L姜黃素作用RPE細胞后，早期均可呈現(xiàn)細胞內(nèi)鈣離子的熒光增強，且與濃度呈正相關。實時定量PCR反應檢測了3.7500 mg/L姜黃素作用RPE細胞48 h后的整合素家族的基因表達，整合素α3和整合素α5基因的表達呈負調節(jié)，呈正調節(jié)的是整合素α4和整合素β5。

整合素α3形成的配體α3β1能與層黏連蛋白、Ⅰ型膠原、纖維連接蛋白結合，有抑制細胞遷移的作用。整合素α5形成的配體α5β1只能與纖維連接蛋白結合，但在細胞黏附中起到重要作用。整合素α4形成的配體可能與纖維連接蛋白結合，整合素β5是玻璃體連接蛋白受體，這兩種整合素的具體作用尚未闡明[27-29]。姜黃素作用后的RPE細胞中，整合素α3和整合素α5基因的表達量顯著下調，可能會減弱RPE細胞與其細胞外基質的黏附。

在各種生理反應中都離不開細胞與細胞間的信息傳遞和相互作用。這些細胞間相互作用和通訊的一種方式是通過由特異性的細胞黏附分子介導的細胞與細胞之間的直接接觸和作用。在正常細胞中，黏附分子的表達及活性都受到嚴格的調控。細胞黏附分子決定細胞游走和定位時細胞間的相互識別；促進細胞的增殖和分化：已知多種類型的正常細胞的生長具有停泊依賴性，當這種黏附被阻斷時，細胞便停止生長，甚至發(fā)生凋亡。體外培養(yǎng)的實驗也顯示，傳代后貼壁生長的細胞必須貼壁后才能生長，表明由黏附分子介導的細胞黏附作用是細胞對生長刺激因子反應的必要條件。大多數(shù)體細胞需要黏附于細胞外基質方能生長，稱為錨著依賴性細胞，在這類細胞中，整合素的角色格外重要，因為這些細胞十分依賴由細胞外基質所提供的生存訊號，所以當整合素的活性被抑制無法傳遞生存訊號給細胞時，就會引發(fā)細胞凋亡，稱之為失巢效應(Anokis)[30]。同大多數(shù)體細胞一樣，RPE細胞也是錨著依賴性細胞，它的存活同樣需要依附于基質蛋白.在RPE細胞表面也分布著多種整合素受體。整合素通過與細胞外基質蛋白結合，對RPE細胞生長、增生、分化、遷移等活動產(chǎn)生重要影響[31-32]。此外，有學者Nishihara研究了胎鼠的腸上皮細胞，提出了胞內(nèi)鈣超載能阻止整合素受體極性分布的改變，而導致細胞凋亡[33-34]。

綜上，姜黃素作為一種天然藥物，作用于人RPE細胞后，早期引起細胞內(nèi)鈣離子濃度的增強，通過細胞內(nèi)信號的傳導，繼而抑制整合素的活性，整合素α3和整合素α5基因的表達量顯著下調，進而破壞細胞和細胞外基質的交互作用，減弱了RPE細胞與其細胞外基質的黏附；或者藉由抑制整合素的活性，影響了細胞運動，破壞細胞剛開始爬行所需的細胞極性的形成，細胞無法立即地決定其要往哪去，如此一來，RPE細胞便不能正常接受從細胞外基質所傳來的生存訊號，整合素所參與相關的生存路徑也因此被抑制，最后造成RPE細胞發(fā)生失巢凋亡。因此姜黃素有望成為一種有效抑制PVR的天然藥物。

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