陳 晨, 王 禹, 張德賢, 傅義程, 陳 曦, 徐 斌, 楊 潔, 尹 彤, 朱慶磊,李 泱

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大蒜素對(duì)兔心房肌細(xì)胞超速激活延遲整流鉀電流的作用

陳 晨, 王 禹, 張德賢, 傅義程, 陳 曦, 徐 斌, 楊 潔, 尹 彤, 朱慶磊,李 泱*

（解放軍總醫(yī)院老年心血管病研究所, 北京 100853）

研究大蒜素對(duì)兔單個(gè)心房肌細(xì)胞超速激活的延遲整流鉀電流（KUr）的作用，探討其抗房性心律失常的機(jī)制。采用雙酶法分離兔單個(gè)心房肌細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞外局部灌流法給藥，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄電流，以觀察大蒜素對(duì)KUr的作用。大蒜素200μmol/L對(duì)正常兔心房肌細(xì)胞KUr有顯著的抑制效應(yīng)，使KUr峰值由（14.5±3.2）pA/pF降至（7.9±1.2）pA/pF (＜0.01，＝15）。大蒜素可使KUr的電流-電壓曲線(xiàn)降低，且隨著除極化電位的增加，作用更加明顯，提示其作用具有電壓依賴(lài)性。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)大蒜素對(duì)KUr的抑制效應(yīng)存在濃度依賴(lài)性，半數(shù)抑制濃度（IC50）為149.6μmol/L。門(mén)控動(dòng)力學(xué)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素可以使通道激活曲線(xiàn)右移，延遲激活；使通道穩(wěn)態(tài)失活左移，加速失活；使通道失活后恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)，減緩?fù)ǖ朗Щ詈蟮脑俅渭せ睢牟煌h(huán)節(jié)減少KUr通道的開(kāi)放，降低電流密度。大蒜素抑制心房肌細(xì)胞膜上KUr，這可能是其治療房性心律失常的細(xì)胞電生理基礎(chǔ)。

大蒜素; 心房肌細(xì)胞; 超速激活延遲整流鉀電流; 膜片鉗技術(shù)

房性心律失常，特別是心房顫動(dòng)（atrial fibrillation，AF），已成為最常見(jiàn)的心律失常之一?？梢鹉X卒中、肺栓塞、心力衰竭、心肌梗死等諸多并發(fā)癥，有著很高的病死率和致殘率[1]。盡管目前有很多藥物正應(yīng)用于AF的治療，但是人們?nèi)韵Ｍ玫揭环N更為安全而有效的抗心律失常藥物[2]。理想的治療AF的藥物應(yīng)具有高度的心房肌細(xì)胞選擇性，可以選擇性地終止或延緩AF的發(fā)生，而不引起室性心律失常。超速激活的延遲整流鉀電流（the ultra rapid delayed rectifier potassium current，KUr）只存在于心房肌細(xì)胞膜上，而在心室肌無(wú)分布，故是構(gòu)成心房肌細(xì)胞復(fù)極化電流的主要成分之一，也是治療房性心律失常的電位靶點(diǎn)[3]。

大蒜素（allitridum，All）是一種從百合科植物大蒜鱗莖中分離出的具有多種生物學(xué)活性的化合物，其化學(xué)名為二烯丙基三硫化物。近年來(lái)，All在防治心血管疾病領(lǐng)域的研究受到重視，已證實(shí)其有減慢竇率、抑制心肌收縮、抗心律失常等作用，能拮抗多種模型動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)性心律失常。資料顯示，All具有明顯的抗房性心律失常的效應(yīng)，但作用機(jī)制尚不明確[4]。本研究選擇兔心房肌細(xì)胞，用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察All對(duì)兔心房肌細(xì)胞KUr的影響，以闡明All的抗AF等房性心律失常作用的細(xì)胞電生理基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 溶液與試劑

膠原酶Ⅱ、胰蛋白酶、牛血清白蛋白、天冬氨酸鉀、丙酮酸鈉、MgATP、HEPES、CaCl2、CdCl2、BaCl2、4-氨基吡啶（4-aminopyridine，4-AP）、dofeilite均為Sigma公司產(chǎn)品；EGTA購(gòu)自Fluka Biochemika；其他試劑均為分析純。Tyrode液的組成成分（mmol/L）：NaCl 135，KCl 5.4，CaCl21.8，MgCl21.0，NaH2PO40.33，HEPES 10，glucose 10，pH值用NaOH調(diào)至7.3；無(wú)鈣Tyrode液和0.2mmol/L Ca2+Tyrode液，分別為T(mén)yrode液中不加CaCl2和加0.2 mmol/LCaCl2。細(xì)胞保護(hù)液（KB液，mmol/L）：KOH 110，taurine 10，oxalic acid 10，glutamic acid 70，KCl 25，KH2PO410，EGTA 5，Hepe 5，glucose 10，以KOH調(diào)pH值至7.4。細(xì)胞外液（mmol/L）：N-methyl-D-glucamine（NMG）149，MgCl25，CaCl20.65，HEPES 5，以HCl調(diào)pH值至7.4。細(xì)胞內(nèi)液（mmol/L）：KCl 45，K-aspartate 85，Na-pytuvate 5，MgATP 5.0，EGTA 10，HEPES 10，glucose 11，用KOH調(diào)pH值至7.4。

1.2 兔單個(gè)心房肌細(xì)胞分離

成年新西蘭兔（1.0～1.5kg），雌雄兼有。購(gòu)自解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。依據(jù)文獻(xiàn)[5]采用酶解法制備心房肌單細(xì)胞并進(jìn)行了改進(jìn)。實(shí)驗(yàn)兔經(jīng)腹腔20%水合氯醛（2ml/kg）麻醉，迅速取心臟，在37℃和通氧條件下行Langendorff 灌流。用無(wú)Ca2+Tyrode￠s液灌流3～5min，用含Ⅱ型膠原酶70mg、胰蛋白酶12mg無(wú)Ca2+Tyrode￠s液灌流（50ml）25～30min以消化心房肌。沿房室間溝取心房肌，剪碎后加入KB液中并吹打使細(xì)胞脫落，并于-4℃保存，1h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取保存液加于1ml灌流槽中，待細(xì)胞貼壁后，于倒置顯微鏡下選擇邊緣整齊、表面無(wú)顆粒、橫紋清晰、無(wú)收縮的細(xì)胞，在37℃下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 藥物及應(yīng)用

All（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）購(gòu)于上海禾風(fēng)制藥有限公司，純品是無(wú)色或淡黃色油狀物，相對(duì)分子質(zhì)量為162。臨用時(shí)采用細(xì)胞外液新鮮配制成結(jié)果中所示終濃度。采用局部灌流裝置于細(xì)胞外恒流灌流方式給藥，為確保藥物效應(yīng)的一致性，待平衡5min后方可記錄電流。

圖1 All的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

Figure 1 Chemical structural formula of allitridum

1.4 干擾電流的排除

向細(xì)胞外液加入BaCl2200μmol/L阻斷K1，加入dofeilite 5nmol/L阻斷Kr，CdCl2100μmol/L阻斷Ca,L，TTX 100μmol/L阻斷Na。參照文獻(xiàn)[6]采用電流減除法消除to干擾。

1.5 全細(xì)胞膜片鉗記錄

采用全細(xì)胞膜片鉗記錄方法，在電流鉗模式下記錄動(dòng)作電位；在電壓鉗制下記錄電流。膜片鉗放大器（AXON-700B，USA）同計(jì)算機(jī)連接。刺激信號(hào)及電壓輸入信號(hào)的采集通過(guò)Digidata1440A數(shù)模轉(zhuǎn)換器由軟件（pCLAMP）控制。玻璃毛坯（GG-17）經(jīng)微電極拉制儀（Narishige，pp-83）拉制成電阻為2.5～5.5MΩ的電極。調(diào)節(jié)三維操縱器進(jìn)行封接，使封接電阻達(dá)1GΩ以上，吸破細(xì)胞膜形成全細(xì)胞記錄模式。細(xì)胞膜電容記錄：施以0.4V/s的斜坡刺激，記錄電流并按方程Cm＝/（dV/dt）計(jì)算細(xì)胞膜電容Cm，其中為電流值，dV/dt即電壓斜率。為消除細(xì)胞間誤差，電流值以電流密度（pA/pF）表示。慢電容及串聯(lián)電流補(bǔ)償為85%～90%。信號(hào)經(jīng)截止頻率為1kHz的四階貝塞爾低通濾波器濾波，采樣率為5kHz。

1.6 參數(shù)的設(shè)定

KUr的電流：保持電位-80mV，施予-40mV，20ms的預(yù)刺激失活鈉通道，隨即給予+50mV，2000ms的脈沖，記錄KUr。

KUr電流-電壓曲線(xiàn)：保持電位-80mV，施予-40mV，20ms的預(yù)刺激失活鈉通道，隨即給予-40mV～+70mV，2000ms的脈沖，記錄KUr。以電流密度與測(cè)試電壓作圖，得到KUr的電流-電壓曲線(xiàn)。

KUr穩(wěn)態(tài)激活曲線(xiàn)：保持電位-80mV，施予-40mV，20ms的預(yù)刺激失活鈉通道，隨即給予-40mV～+70mV，4000ms的脈沖，記錄KUr。標(biāo)準(zhǔn)化各電流幅值，以相對(duì)電流對(duì)各膜電位作圖得到穩(wěn)態(tài)激活曲線(xiàn)，并用Boltzmann方程“/max＝{1+exp[(1/2,act-m)/act]}-1”進(jìn)行曲線(xiàn)擬合，其中1/2為半激活電壓，為激活曲線(xiàn)斜率。

KUr穩(wěn)態(tài)失活曲線(xiàn)：采用典型的雙刺激模式，保持電位-80mV，施予-40mV，20ms的預(yù)刺激失活鈉通道，緊接著給予+60mV，5000ms的條件刺激，緊接著給予-40～+50mV，階躍5mV的系列測(cè)試刺激，記錄殘存KUr。標(biāo)準(zhǔn)化各電流幅值，以相對(duì)電流對(duì)各膜電位作圖得穩(wěn)態(tài)失活曲線(xiàn)。用Boltzmann方程“/max＝{1+exp[-（1/2,inact-m）/]}-1”進(jìn)行曲線(xiàn)擬合求出半失活電壓（1/2）和曲線(xiàn)斜率（inact）。

KUr失活后恢復(fù)曲線(xiàn)：采用典型的雙刺激模式，保持電位-80mV，施予-40mV，20ms的預(yù)刺激失活鈉通道，緊接著給予+60mV，2000ms的條件刺激，間隔100，200，300，400，500，600，700，800ms，給予+60mV，2000ms的測(cè)試刺激，記錄KUr。標(biāo)準(zhǔn)化各電流幅值，以相對(duì)電流對(duì)間隔時(shí)間作圖，得失活后恢復(fù)曲線(xiàn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 All對(duì)心房肌IKUr峰值電流密度的作用

正常的急性分離的兔心房肌細(xì)胞KUr電流密度為（14.5±2.2）pA/pF，該電流對(duì)4-AP敏感，100μmol/L的4-AP幾乎可以將其阻斷。應(yīng)用200μmol/L的All后可使其電流密度明顯降至（9.9±1.2）pA/pF（＜0.01，＝15）。給予50，100，200，400μmol/L的All后發(fā)現(xiàn)藥物的抑制效應(yīng)隨著濃度增加而增強(qiáng)，呈現(xiàn)出濃度依賴(lài)性特征，半數(shù)抑制濃度（IC50）為149μmol/L，Hill系數(shù)為0.71（圖2）。

2.2 All對(duì)心房肌IKUr電流-電壓曲線(xiàn)的作用

隨著電壓向除極化方向增加，電流密度增大，且呈一定的外整流特征。當(dāng)細(xì)胞暴露于All 200μmol/L時(shí)，KUr在正于＋10mV的各電壓下電流密度明顯降低，隨著電壓向除極化的方向移動(dòng)，這種效應(yīng)更加明顯。電流的外向整流特征也相對(duì)降低，用藥后的KUr電流-電壓曲線(xiàn)近乎直線(xiàn)（圖3）。

圖2 All對(duì)心房肌細(xì)胞IKUr電流的濃度依賴(lài)性作用

Figure 2 Concentration-dependent effect of allitridum on atrial myocytesKUrcurrent

A: 對(duì)KUr作用原始電流圖(＋50mV); B: 對(duì)KUr峰值的作用; C: 對(duì)KUr作用的濃度依賴(lài)性。與對(duì)照組比較,P＜0.01

圖3 All對(duì)心房肌細(xì)胞IKUr電流-電壓曲線(xiàn)的作用

Figure 3 Effect of allitridum on atrial myocytesKUrcurrent-voltage curve

A: 對(duì)KUr作用原始電流圖; B: I-曲線(xiàn)。與對(duì)照組比較,P＜0.05,P＜0.01

2.3 All對(duì)心房肌細(xì)胞IKUr激活曲線(xiàn)的作用

與對(duì)照細(xì)胞的電流比較，應(yīng)用All 200μmol/L后，KUr的穩(wěn)態(tài)激活曲線(xiàn)右移，即向除極化方向移動(dòng)，1/2,act從對(duì)照的（-13.67±1.24）mV正移到（-2.38±0.11）mV（＝14，＜0.01），且激活曲線(xiàn)斜率act也有降低，在用藥前后分別為（10.32±0.94）mV和（6.21±0.57）mV（＝14，＜0.01；圖4）。

2.4 All對(duì)心房肌細(xì)胞IKUr失活曲線(xiàn)的作用

如圖5所示，應(yīng)用All 200μmol/L后，KUr的失活曲線(xiàn)左移，即向超極化方向移動(dòng)，1/2,inact從對(duì)照的（-6.32±0.46）mV移到（-12.67±1.11）mV（＝14，＜0.01），但藥物對(duì)穩(wěn)態(tài)失活曲線(xiàn)斜率inact影響不大。

2.5 All對(duì)心房肌IKUr失活后恢復(fù)動(dòng)力學(xué)的作用

標(biāo)準(zhǔn)化各電流幅值，以相對(duì)電流對(duì)間隔時(shí)間作圖，得到失活后恢復(fù)曲線(xiàn)，由圖6可見(jiàn)，All 200μmol/L可使恢復(fù)曲線(xiàn)明顯減慢，此現(xiàn)象在恢復(fù)的前400ms表現(xiàn)尤甚，恢復(fù)時(shí)間常數(shù)τ從對(duì)照的（134.6±13.9）ms移到（215.8±13.6）ms（＝14，＜0.01）。提示，在同一時(shí)間間隔下，通道恢復(fù)速率降低，電流幅值減少。

3 討 論

KUr是一種僅在心房肌細(xì)胞特異表達(dá)的離子通道電流，主要是心房肌細(xì)胞復(fù)極Ⅱ期的外向離子流，可促進(jìn)動(dòng)作電位3期復(fù)極，是有效不應(yīng)期和動(dòng)作電位時(shí)限的決定因素之一[7]。同時(shí)KUr對(duì)信號(hào)傳遞、心肌細(xì)胞興奮性、不應(yīng)性、傳導(dǎo)性穩(wěn)態(tài)的維持有重要作用。KUr出現(xiàn)異常是AF時(shí)心房肌電重構(gòu)的重要特征，因此也成為研究AF發(fā)生機(jī)制的關(guān)鍵指標(biāo)和治療房性心律失常的電位靶點(diǎn)[8,9]。目前，一系列的KUr阻滯劑治療AF的療效正在評(píng)估中[10]。

圖4 All對(duì)H2O2致兔心房肌細(xì)胞IKUr激活曲線(xiàn)改變的作用

Figure 4 Effect of allitridum on H2O2-induced change of rabbit atrial myocytesKUractivation curve

A: 對(duì)KUr穩(wěn)態(tài)激活曲線(xiàn)的作用; B: 對(duì)KUr半激活電壓的作用; C: 對(duì)KUr激活曲線(xiàn)斜率的作用。與對(duì)照組比較,P＜0.05,P＜0.01

本研究通過(guò)All對(duì)兔單個(gè)心房肌細(xì)胞KUr的效應(yīng)觀察，發(fā)現(xiàn)All可直接抑制KUr，使其峰值顯著降低。而且，此抑制作用存在電壓依賴(lài)性，即隨著除極化電位的增加，作用更加明顯。同時(shí)發(fā)現(xiàn)All對(duì)KUr的抑制效應(yīng)存在濃度依賴(lài)性。進(jìn)一步的門(mén)控動(dòng)力學(xué)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，All可以使通道激活曲線(xiàn)右移，延遲激活；使通道穩(wěn)態(tài)失活左移，加速失活；使通道失活后恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)，減緩?fù)ǖ朗Щ詈蟮脑俅渭せ睢牟煌h(huán)節(jié)減少通道的開(kāi)放，這可能是其降低KUr電流密度的主要機(jī)制。之前學(xué)者已證實(shí)All具有拮抗多種模型動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)性心律失常的效應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)其可降低心房自律性、興奮性，延長(zhǎng)有效不應(yīng)期及收縮性，減慢房室傳導(dǎo)。本研究的結(jié)果至少可以從細(xì)胞水平部分地揭示All抗房性快速心律失?；駻F的電生理機(jī)制。

然而，研究心肌細(xì)胞KUr通道阻滯劑的效應(yīng)性較為復(fù)雜。首先，KUr與其他電流特別是瞬時(shí)外向鉀電流（to）有潛在的重疊，如何區(qū)分則顯得十分重要，本研究采用了電流減除法消除to干擾，以求結(jié)果反映真實(shí)客觀情況。其次，尚無(wú)選擇性的特異工具藥可供選擇，但其對(duì)4-AP較其他鉀電流敏感得多，已有不少實(shí)驗(yàn)應(yīng)用4-AP作為鑒定該電流的工具藥。最后，還有各種疾病可引起KUr的電重塑[11]，故本研究雖然發(fā)現(xiàn)All對(duì)正常心房肌細(xì)胞KUr具有電壓依賴(lài)性和濃度依賴(lài)性阻滯效應(yīng)以及可能的門(mén)控機(jī)制，但是否與對(duì)AF時(shí)KUr的作用一致還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

在過(guò)去的十年中，對(duì)KUr阻滯劑的研究迅速開(kāi)展。諸多KUr的阻滯藥已被證實(shí)在AF動(dòng)物模型中有很好的療效[12-14]。Ford等[15]發(fā)現(xiàn)XEN-D0101通過(guò)對(duì)心房肌細(xì)胞KUr等電流的抑制發(fā)揮治療慢性AF作用。對(duì)新的KUr阻滯劑治療AF的評(píng)價(jià)顯示，單純的阻斷KUr通道不足以抑制AF。多數(shù)藥物在作用于KUr的同時(shí)還作用于其他通道[16]。文獻(xiàn)報(bào)道All還有抑制Na、Ca,L和其他鉀通道電流的作用。因此，我們認(rèn)為All通過(guò)抑制KUr及聯(lián)合其他通道的多重效應(yīng)而發(fā)揮其抗房性心律失常的作用。

圖5 All對(duì)兔心房肌細(xì)胞IKUr失活曲線(xiàn)的作用

Figure 5 Effect of allitridum on rabbit atrial myocytesKUrinactivation curve

A: 對(duì)KUr穩(wěn)態(tài)失活曲線(xiàn)的作用; B: 對(duì)KUr半失活電壓的作用; C: 對(duì)KUr失活曲線(xiàn)斜率的作用。與對(duì)照組比較,P＜0.01

圖6 All對(duì)兔心房肌細(xì)胞IKUr失活恢復(fù)動(dòng)力學(xué)的影響

Figure 6 Effect of allitridum on rabbit atrial myocytesKUrrecovery from inactivation

A: 對(duì)KUr失活后恢復(fù)作用的原始記錄; B: 對(duì)KUr恢復(fù)動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)的作用

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（編輯: 王雪萍）

Effects of allitridum on ultra rapid delayed rectifier potassium current in rabbit atrial cardiomyocytes

CHEN Chen, WANG Yu, ZHANG De-Xian, FU Yi-Cheng, CHEN Xi, XU Bin, YANG Jie, YIN Tong, ZHU Qing-Lei, LI Yang*

(Institute of Geriatric Cardiology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

To determine the effect of allitridum on the ultra rapid delayed rectifier potassium current (KUr) in single rabbit atrial cardiomyocyte, and investigate the mechanism of its anti-atrial arrhythmia.The dual enzymatic method was used to separate single rabbit atrial cardiomyocyte. The drug was appliedextracellular supserfusion, and current was evoked and recorded using Axon MultiClamp 700B amplifier.Allitridum at 200μmol/L exerted obvious inhibitory effect onKUrin normal rabbit atrial cardiomyocyte, and decreased the peak value from (14.5±3.2) to (7.9±1.2)pA/pF (＜0.01,＝15). Allitridum also resulted in a decrease in current-voltage curve, and the effect became more significant with the increase of depolarization potential, in a voltage-dependent manner. Allitridum also showed the inhibitory effect onKUrin a dose-dependent manner, with its IC50value of 149.6μmol/L. Allitridum caused a significant positive shift of the steady-state activation curve ofKUr, and then delayed the activation, while a markedly negative shift of the steady-state inactivation ofKUr, and so accelerated the inactivation. Furthermore, the drug markedly lengthened the time constants forKUrrecovery from inactivation, and decelerated the re-inactivation after inactivation. It decreased the channel open at many links, and reduced current density.Allitridum derived from Chinese herb, garlic bulb, potently blocksKUr, which might be the underlying cellular electrophysiological mechanism of its therapeutic effect on atrial arrhythmia.

allitridum; atrial cardiomyocytes; ultra rapid delayed rectifier potassium current; patch clamp technique

(No.30772886).

R285.5

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00095

2013-03-18;

2013-04-03

國(guó)家自然科學(xué)基金（No. 30772886）

李 泱, Tel: 010-66936762, E-mail: liyangbsh@163.com