王慧，張亞麗，王遠志，陳創(chuàng)夫，任曉麗

（1石河子大學醫(yī)學院，新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，石河子 832002；2石河子大學動物科技學院，石河子 832003）

布魯氏菌病是由布魯氏菌屬（Brucella）成員引起的一種慢性人畜共患傳染?。?－2］。人感染后表現(xiàn)為持續(xù)發(fā)熱、多汗及肝脾腫大，家畜感染后可造成流產(chǎn)、空懷等［3］。目前，此病已使全世界遭受了巨大的經(jīng)濟損失。近年來，隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，我國和世界部分地區(qū)布魯氏菌病的人畜疫情均出現(xiàn)回升勢頭［4］。

布魯氏菌外膜蛋白OMP31是布魯氏菌高度保守的特異性蛋白［5］，也是一種公認的毒力因子［6］，其和細菌脂多糖成分一樣均能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生保護性的免疫反應(yīng)［7］。目前國外許多學者對布魯氏菌omp31基因均有研究，Gupta等［8］利用羊種布魯氏菌16M構(gòu)建出可編碼外膜蛋白OMP31的DNA疫苗，證明了該疫苗具有介導(dǎo)小鼠細胞免疫及體液免疫的功能；Grilló等［9］利用羊種布魯氏菌Rev.1株構(gòu)建了bp26及bp26／omp31基因缺失株，為建立一種針對同時感染綿羊種及羊種布魯氏菌的新型疫苗奠定基礎(chǔ)。

因此，本研究將構(gòu)建羊種布魯氏菌16MΔomp31基因缺失株，并對其遺傳穩(wěn)定性進行檢測，旨在為進一步揭示布魯氏菌對感染細胞的抗凋亡機制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

羊種布魯氏菌16M國際標準株、枯草芽孢桿菌B115株、大腸桿菌E.coli DH5α克隆菌株均由新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基、試劑、主要試劑盒

Brucella Broth培養(yǎng)基及Brucella Broth Agar培養(yǎng)基均購自美國BD公司；Taq DNA聚合酶購自北京天根生物有限公司，限制性核酸內(nèi)切酶（Sph I、Xho I、BamH I、Sac I）及 T4DNA 連接酶、DNA Marker均購自Takara公司；pGEM－7Zf＋自殺性質(zhì)粒購自Promega公司；pMD18－T載體購自Takara公司；DNA凝膠回收試劑盒、高純度質(zhì)粒DNA小提中量試劑盒購自北京天根生物公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物

所用引物均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。序列見表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 Sequences of PCR primers

1.2.2 同源臂及SacB基因的擴增

以布魯氏菌16M國際標準株基因組為模板，分別以引物omp31－N－F、omp31－N－R，擴增出omp31的N端同源臂。

PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，66.6℃退火40s，72℃延伸1min 10s，30個循環(huán)；最后延伸72℃7min。

再以布魯氏菌16M為模板利用引物omp31－CF、omp31－C－R，擴增出omp31的 C端同源臂，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，67.2℃退火40s，72℃延伸1min 10s，35個循環(huán)；最后延伸72℃7min。

最后以枯草芽孢桿菌B115株為模板利用引物sacB－F、sacB－R 擴增出 SacB 基因，PCR 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，56℃退火40 s，72℃延伸2min，30個循環(huán)；最后延伸72℃10 min。

所得產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收，連接T載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli DH5α克隆菌株，送華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.3 pGEM－7zf＋－Δomp31－sacB同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將測序正確的菌液提質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶Sph I／Xho I、Xho I／BamH I、BamH I／Sac I分別酶切omp31的N端同源臂、C端同源臂、SacB質(zhì)粒及自殺載體pGEM－7zf＋，并利用T4DNA連接酶連與重組自殺載體上，構(gòu)建成自殺性質(zhì)粒pGEM－7zf＋－Δomp31－sacB，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli DH5α克隆菌株，送華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.4 布魯氏菌omp31基因缺失株的篩選及鑒定

取約2μL（250ng／μL）自殺性質(zhì)粒加入到200 μL布魯氏菌16M感受態(tài)細胞中混勻，冰上靜置15 min，移入2mm電擊杯中，E＝2.5KV／cm電擊，立即加入到37℃預(yù)熱的800LBrucella Broth培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)24h后，8000r／min離心2min，吹打混勻，涂布于含100mg／L Ampr抗性的布魯氏菌固體培養(yǎng)基進行1次同源重組，37℃培養(yǎng)48－72 h后，挑取單菌落做PCR鑒定。

將陽性菌落加液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，取100 μL菌液涂布于含8%蔗糖的布魯氏菌固體培養(yǎng)基，進行2次同源重組，所得陽性菌命名為16MΔomp31。

1.2.5 對16MΔomp31進行遺傳穩(wěn)定檢測

將獲得的16MΔomp31基因缺失株在Brucella Broth無抗板上傳至3代后，挑取單菌落滅活并做菌落PCR，將所獲得條帶回收后與pMD18－T載體連接后送華大基因科技股份有限公司測序，測序正確后繼續(xù)在無抗板上傳至15代，得到穩(wěn)定的16MΔomp31基因缺失株。

2 結(jié)果與分析

2.1 omp31同源臂及SacB基因的PCR擴增鑒定

以布魯氏菌16M國際標準株為模板，擴增出omp31的N端同源臂目的條帶大小為1056bp（圖1）；擴增出omp31的C端同源臂目的條帶大小為1046bp（圖2），以枯草芽孢桿菌為模板，擴增出SacB基因目的條帶大小為1477bp（圖3）；目的條帶大小均與預(yù)期一致。

圖1 omp31N端同源臂PCR擴增Fig.1 PCR amplification of omp31 N－terminal homologous arm

圖2 omp31C端同源臂PCR擴增Fig.2 PCR amplification of omp31 C－terminal homologous arm

圖3 SacB基因PCR擴增Fig.3 PCR amplification of SacB gene

2.2 同源重組質(zhì)粒pGEM－7zf＋－Δomp31－sacB酶切鑒定

結(jié)果見圖4

圖4 同源重組質(zhì)粒pGEM－7zf＋－Δomp31－sacB酶切鑒定Fig.4 Homologous recombination plasmid of pGEM－7zf＋ －Δomp31－sacB restriction enzyme digestion

由圖4可見，利用限制性內(nèi)切酶Sph I／Xho I、Xho I／BamH I、BamH I／Sac I酶切質(zhì)粒 pGEM－7zf＋－Δomp31－sacB，得到omp31的N端同源臂1056bp、omp 31的C端同源臂1046bp、SacB基因1477bp，結(jié)果與預(yù)期一致。

2.3 布魯氏菌16M國際標準株omp31基因缺失株的篩選

挑取電轉(zhuǎn)化后在Ampr抗性Brucella Broth培養(yǎng)基上生長的單菌落，用JC－F／JC－R做PCR鑒定，得到缺失后目的片段846bp，與未缺失目的片段1671bp，證明線性化的同源重組質(zhì)粒已插入到16 M國際標準株的染色體上（圖5）。再將陽性菌離心后涂布于含8%蔗糖的Brucella Broth Agar培養(yǎng)基，挑取單菌落做PCR鑒定，獲得缺失后目的片段846bp，證明已成功構(gòu)建布魯氏菌16MΔomp31基因缺失株（圖6）。

圖5 1次同源重組的PCR鑒定Fig.5 Identification of the first recombinant strain of 16MΔomp31by PCR

圖6 2次同源重組的PCR鑒定Fig.6 Identification of the second recombinant strain of 16MΔomp31by PCR

2.4 布魯氏菌16MΔomp31遺傳穩(wěn)定檢測

將所獲得基因缺失株送測序，所得結(jié)果與同源臂上的目的基因比對同源性達100%，繼續(xù)傳至15代未發(fā)生回復(fù)性突變，得到具有遺傳穩(wěn)定性的16MΔomp31的基因缺失株（圖7）。

圖7 16MΔomp31遺傳穩(wěn)定性檢測Fig.7 Genetic stability test of 16MΔomp31

3 討論

布魯氏菌病是一種古老的人獸共患病，嚴重危害著人及多種動物的生命安全［10］，此外還被一些西方國家列為恐怖戰(zhàn)劑之一［11］。在我國主要以羊布魯氏菌最為多見且其致病力最強，羊布魯氏菌強毒株16M是典型胞內(nèi)寄生菌，2002年DelVecchio［12］等人完成羊種布魯氏菌16M株的全基因組序列測定工作，該項結(jié)果提供了羊種布魯氏菌基因組大小、結(jié)構(gòu)及生態(tài)復(fù)雜性等信息，為布魯氏菌遺傳進化關(guān)系提供分子生物學基礎(chǔ)。

布魯氏菌為兼性胞內(nèi)寄生菌［13］，人感染后常表現(xiàn)為慢性持續(xù)性感染，不易治愈［14］。巨噬細胞是布魯氏菌生存和繁殖的靶細胞［15］。布魯氏菌與巨噬細胞間胞內(nèi)寄生關(guān)系對布魯氏菌的慢性感染至關(guān)重要［16］。OMP31是布魯氏菌一種重要的外膜蛋白，Laloux等［17］在酵母中進行了布魯氏菌的全基因組的功能篩選，在啤酒酵母中篩選到羊種布魯氏菌外膜蛋白OMP2b可抑制Bax誘導(dǎo)的細胞凋亡，因此我們推斷布魯氏菌的某些重要外膜蛋白可能會抑制細胞凋亡中蛋白的表達，從而抑制宿主細胞的凋亡。王遠志等［18］運用酵母雙雜交方法證明布魯氏菌外膜蛋白OMP31與巨噬細胞的趨化因子（C－X－C）配體16有相互作用，并利用RNA干擾技術(shù)作用于巨噬細胞的趨化因子（C－X－C）配體16，布魯氏菌感染的巨噬細胞凋亡程度加快，胞內(nèi)生存能力明顯減低，說明與布魯氏菌外膜蛋白OMP31互作的宿主因子在布魯氏菌的胞內(nèi)寄生機凋亡中起關(guān)鍵作用。

因此，本實驗利用常規(guī)分子生物學技術(shù)構(gòu)建布魯氏菌16MΔomp31基因缺失株，為進一步揭示omp31可能對布魯氏菌胞內(nèi)生存能力及參與巨噬細胞凋亡調(diào)節(jié)作用奠定了實驗基礎(chǔ)。

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