潘曉倩 成曉瑜 張順亮等

摘 要：以豬血紅蛋白為原料，利用篩選出的蛋白酶水解制備抗菌肽，以酶解液抑菌率和水解度為指標(biāo)，通過單因素試驗對酶解溫度、加酶量和酶解時間3個主要工藝參數(shù)進行研究，在此基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝，建立數(shù)學(xué)模型。結(jié)果表明，胰蛋白酶最適合水解豬血紅蛋白制備抗菌肽，其最佳條件為酶解溫度49.72℃、加酶量2852.81U/g、酶解時間5.19h，酶解產(chǎn)物抑菌率的理論預(yù)測值89.70%，實際測量值90.32%?？梢姡靡鹊鞍酌杆庳i血紅蛋白能夠得到抑菌活性較高的酶解產(chǎn)物，且該模型能夠較好的預(yù)測抗菌肽制備最佳工藝條件。

關(guān)鍵詞：豬血紅蛋白；抗菌肽；酶解；響應(yīng)面

中圖分類號：TS251.1 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2013）11-0001-05

抗菌肽（antibacterial peptide，ABP）是生物體天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，多數(shù)是一類分子質(zhì)量小于10kD，帶有正電荷，在鏈長、序列及結(jié)構(gòu)方面具有多樣性的兩親性肽類[1-2]。抗菌肽具有抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性高、安全高效等諸多優(yōu)點，食物源蛋白抗菌肽的制備成為生物領(lǐng)域的研究熱點之一[3-4]。目前抗菌肽的制備方法有：從動植物組織中直接提取法、化學(xué)合成法、基因工程法和酶解法。因酶解法具有反應(yīng)條件溫和、過程容易控制等諸多優(yōu)點，被認為是大批量制備抗菌肽最有前途的方法[5-6]。因酶在剪切肽鍵時具有一定特異性，當(dāng)選取的酶解底物不同時，也應(yīng)選取不同種類的酶進行水解以獲得抗菌性。如Pellegrini等[7]用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶酶解牛乳α-乳清蛋白均可以得到抗菌組分，而用胃蛋白酶水解得到的多肽組分則無抗菌性。吳林澤等[8]發(fā)現(xiàn)用堿性蛋白酶酶解羅非魚下腳料所得粗肽組分對金黃色葡萄球菌具有很好的抗菌性。

目前，我國生豬屠宰加工產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，2012年，我國生豬出欄69628萬頭，增長5.2%，豬肉產(chǎn)量達到5335萬噸，增長了5.6%[9]。豬血是生豬屠宰加工過程中的主要副產(chǎn)物之一，營養(yǎng)價值很高，素有“液態(tài)肉”之稱[10]，我國豬血資源非常豐富，但利用率低，不超過10%，如被加工成血粉作為飼料添加劑，用于生化制藥中血紅素、蛋白胨的生產(chǎn)，這些產(chǎn)品附加值低，而大多數(shù)作為廢棄物直接排出，造成了資源浪費和環(huán)境污染[11]。歐美、日本等發(fā)達國家將豬血開發(fā)成肽類試劑、肽類藥物等多種功能食品及食品添加劑，普遍推廣，利用率達50%以上[12]。因此，以豬血為底物開發(fā)生物活性肽，可以提高生豬屠宰加工企業(yè)產(chǎn)品附加值，顯示出巨大的市場前景[13]。

本實驗以豬血紅蛋白抗菌肽復(fù)合物為研究對象，選取最佳酶類進行水解，并以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用單因素試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化抗菌肽制備的酶解工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬血采自北京資源集團；金黃色葡萄球菌 中國肉類食品綜合研究中心檢測中心實驗室。

NaOH、鹽酸、乙醇、NaCl（分析純） 北京化學(xué)試劑廠；甲醛溶液（分析純，質(zhì)量分?jǐn)?shù)37.0%～40.0%） 西隴化工股份有限公司；中性蛋白酶（枯草芽孢桿菌）、堿性蛋白酶（枯草桿菌）、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶（米曲霉） 諾維信（中國）投資有限公司；胰蛋白酶（胰臟）、木瓜蛋白酶（木瓜）、胃蛋白酶（豬胃） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；平板計數(shù)瓊脂、營養(yǎng)肉湯 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-IID型超聲波細胞破碎機 北京久潤天誠科技發(fā)展有限公司；KDY-9820凱氏定氮儀 北京市通潤源機電技術(shù)有限責(zé)任公司；PB-10型數(shù)顯酸度計 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；GL-20G-II型高速冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；SL502N型電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；202A-0恒溫干燥箱 上海和盛有限公司；生物安全柜 新加坡Esco公司；F1-45型恒溫培養(yǎng)箱、G154DWS濕熱滅菌鍋 日本三洋公司；CLW-002中空纖維超濾組件 北京旭邦膜設(shè)備有限責(zé)任公司；LM-125中空纖維超濾試驗裝置 北京旭成超濾設(shè)備廠；LGJ-30D冷凍干燥機 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶活力測定

采用Folin-酚法[14]。

1.3.2 豬血紅蛋白的制備[15]

屠宰過程中采集新鮮豬血，并迅速加入質(zhì)量濃度為5g/L的檸檬酸鈉抗凝，4℃保存。將新鮮豬血在4℃、8000r/min離心10min，收集下層沉淀，以獲得紅血球及血漿；并加入同等體積的蒸餾水，超聲波細胞破碎輔助溶血20min，然后在4℃、4000r/min離心10min，得到血紅蛋白溶液，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 豬血紅蛋白酶解物的制備

取適量血紅蛋白溶液，在不同水解酶適宜條件下加入酶制劑進行酶解，酶解過程中不斷攪拌，并且通過滴加1mol/L NaOH溶液或HCl溶液維持體系pH值，不同蛋白酶酶解適宜條件見表1。酶解結(jié)束后，沸水浴10min，冷卻，調(diào)節(jié)pH值至7.0左右，8000r/min離心15min，獲得上清酶解液4℃冷藏備用。

1.3.4 豬血紅蛋白酶解物分離及脫色[16]

采用中空纖維超濾設(shè)備，選取截留分子質(zhì)量為10kD的纖維柱對豬血紅蛋白酶解產(chǎn)物進行分離及脫色，以除去大分子蛋白類物質(zhì)，然后將分離物冷凍干燥、―20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 水解度的測定

水解度是衡量蛋白質(zhì)水解程度的重要指標(biāo)之一，水解度越大，表明蛋白質(zhì)水解越徹底，游離氨基酸的含量越高。總氮測定采用微量凱氏定氮法[17]；游離氨基氮測定采用甲醛滴定法[18]。

1.3.6 抗菌肽抑菌率的測定

采用活菌計數(shù)法[19]，略作修改。將金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)至對數(shù)生長期并用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，調(diào)整細菌最終菌落數(shù)為2.0×103CFU/mL，吸取細菌培養(yǎng)物200μL至無菌Eppendorf管中，共2管，1管為實驗管，1管為對照管。實驗管中加入800μL經(jīng)0.45μm濾膜過濾的質(zhì)量濃度為25mg/mL的豬血紅蛋白抗菌肽，終體積為1mL；對照管中加入800μL無菌生理鹽水。將各管中液體混勻后，于37℃條件振蕩孵育60min后取200μL涂布于平板計數(shù)瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h后，觀察并紀(jì)錄每個營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落數(shù)量。根據(jù)稀釋度和接種量計算出每管原液中的細菌數(shù)量，按下述公式計算抑菌率：

1.3.7 單因素優(yōu)化試驗

以酶解液的水解度和對金黃色葡萄球菌的抑菌率為指標(biāo)，分別研究酶解時間、溫度、加酶量3個主要工藝參數(shù)對酶解效果的影響。

1.3.8 酶解條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，以對金黃色葡萄球菌的抑菌率為響應(yīng)值，通過Design-Expert 8.0軟件采用3因素3水平的Box-Behnken試驗設(shè)計原理設(shè)計響應(yīng)面試驗，考察酶解時間、加酶量和酶解溫度這3個單因素及交互作用對酶解效果的影響。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均是經(jīng)過3次平行試驗得到的平均值，Excel 2007 統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)，計算標(biāo)準(zhǔn)誤并制圖，使用Design Expert 8.0分析響應(yīng)面數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳水解酶的選擇

不同水解酶酶解豬血紅蛋白得到的酶解液抑菌效果差異很大，其中堿性蛋白酶和胰蛋白酶的效果較好，抑菌率分別達到82.62%和88.42%，而風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解產(chǎn)物則沒有任何抑菌效果，甚至還會促進菌的生長，其原因可能與酶解底物特異性及酶的作用肽鍵具有特異性有關(guān)，當(dāng)選取的酶解底物不同時，也應(yīng)選取不同種類的酶進行水解以獲得抗菌性。同時，由表2還可看出，在用不同水解酶作用時，其抑菌效果的好壞與水解度的高低沒有直接關(guān)系，考慮本實驗以抗菌肽的制備為目的，因此選擇胰蛋白酶進行后續(xù)實驗。

2.2 胰蛋白酶水解的單因素試驗結(jié)果

2.2.1 酶解溫度對酶解液抑菌率和水解度的影響

在加酶量3000U/g，pH值調(diào)至8.0的條件下，分別在30、35、40、45、50、55℃的溫度下酶解5h，考察不同酶解溫度對酶解效果的作用。由圖2可知，當(dāng)酶解溫度在30～50℃范圍內(nèi)升高時，酶解液抑菌率和水解度均呈現(xiàn)上升趨勢，而當(dāng)酶解溫度升至55℃時，抑菌率和水解度均開始下降。在一定溫度范圍內(nèi)的升溫有助于酶活性的增加，從而提高酶解效率，但超出這個范圍就會降低酶的活性。同時，血紅蛋白水解程度越大，水解產(chǎn)物的抑菌效果就越好，二者變化趨勢相近，這與胡志和等[20]在水解酪蛋白制備抗菌肽時所得的結(jié)論相同。

2.2.2 加酶量對酶解液抑菌率和水解度的影響

在酶解溫度50℃，pH值調(diào)至8.0的條件下，分別在加酶量為1000、1500、2000、2500、3000、3500U/g的條件下酶解5h，考察不同加酶量對酶解效果的作用。由圖3可知，當(dāng)加酶量在1000～3000U/g的范圍內(nèi)增加時，抑菌率和水解度都快速增加，當(dāng)達到3500U/g時，兩者均有所下降。原因可能是當(dāng)?shù)孜镞^量時，加酶量的增加能促進水解，進而產(chǎn)生更多的活性肽，抑菌率增加，但加酶量繼續(xù)增加導(dǎo)致酶過量，可能會導(dǎo)致活性肽過度水解成為無活性小片段或者造成酶的自身水解，降低酶活性。

2.2.3 酶解時間對酶解液抑菌率和水解度的影響

在加酶量3000U/g、酶解溫度50℃、pH值調(diào)至8.0的條件下，分別酶解1、2、3、4、5、6h，考察不同酶解時間對酶解效果的作用。由圖4可知，酶解產(chǎn)物的抑菌率隨著酶解時間的延長而增加，到5h時，抑菌率和水解度均達到最大，到6h時，有所下降，可能由于過長時間水解造成酶自身分解，水解度降低后導(dǎo)致水解產(chǎn)物抑菌率的降低。

2.3 酶解條件響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與方差分析

回歸系數(shù)顯著性檢驗顯示：一次項A、B的P值均小于0.05，達到顯著水平；一次項C的P值小于0.01，達到極顯著水平，說明酶解溫度、加酶量和酶解時間3個因素均對酶解液的抑菌效果具有顯著影響。A2、B2、C2項P值均小于0.01，說明這3個因素對響應(yīng)值具有極顯著的二次效應(yīng)，它們與抑菌率之間的關(guān)系符合曲線規(guī)律。交互項AB項P值小于0.01，表明溫度與加酶量交互作用極顯著；AC項P值小于0.05，表明溫度與酶解時間的交互作用顯著。由P值可知，在試驗范圍內(nèi)影響酶解液抑菌效果的因素依次為：酶解溫度<加酶量<酶解時間。

2.3.2 響應(yīng)面分析

2.4 驗證實驗

通過Design Expert8.0軟件分析，血紅蛋白通過胰蛋白酶酶解所得酶解液抑菌效果最好的工藝條件為：酶解溫度49.72℃、加酶量2852.81U/g、酶解時間5.19h，此時所得酶解液的抑菌率為89.70%。為了檢驗該方法所得結(jié)果的可靠程度，在上述最佳反應(yīng)條件下進行豬血紅蛋白酶解反應(yīng)，所得酶解液經(jīng)脫色冷凍干燥后檢測其抑菌效果，得到的抑菌率實際值平均為90.32%，相對誤差為0.691%，可見該模型能較好地預(yù)測豬血紅蛋白抗菌肽的實際制備情況。

3 結(jié) 論

利用7種酶水解豬血紅蛋白發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶酶為制備抗菌肽的最佳用酶。通過單因素試驗確定了抗菌肽制備過程中酶解溫度、加酶量和酶解時間的最適范圍。在單因素的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken模型響應(yīng)面設(shè)計方法進一步優(yōu)化胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白制備抗菌肽的工藝條件。通過Design Expert8.0軟件分析得其最優(yōu)條件為：酶解溫度49.72℃、加酶量2852.81U/g、酶解時間5.19h，對響應(yīng)面的結(jié)果進行驗證，酶解產(chǎn)物的抑菌率平均值為90.32%。本實驗以對金黃色葡萄球菌的抑菌率為指標(biāo)，探討了響應(yīng)面法優(yōu)化胰蛋白酶水解豬血紅蛋白制備抗菌肽的工藝條件，為酶解液中抗菌肽的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定提供了實驗依據(jù)。同時，可進一步選取其他常見的指示菌表征酶解產(chǎn)物的抑菌效率。

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