張順亮 潘曉倩 成曉瑜等

摘 要：牛骨膠原蛋白經(jīng)中性蛋白酶水解，采用超濾技術(shù)和凝膠層析技術(shù)對酶解液進(jìn)行分離純化并測定對大腸桿菌的抑菌活性；借助反向高效液相色譜和基質(zhì)輔助激光解析/離子化串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀對抑菌肽進(jìn)行分析。結(jié)果表明：經(jīng)超濾分離后，分子質(zhì)量小于10kD的組分對大腸桿菌的抑菌活性強(qiáng)；Sephadex G-25柱分離得到的峰Ⅰ和峰 Ⅳ 組分有較強(qiáng)的抑菌活性。經(jīng)反向高效液相色譜和基質(zhì)輔助激光解析/離子化串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀分析，峰Ⅰ組分中含有的多肽種類多，分子質(zhì)量集中在850～1550D之間。峰Ⅳ組分含有的多肽種類較少，分子質(zhì)量集中在700～900D之間。

關(guān)鍵詞：牛骨；酶解；超濾；抑菌肽

中圖分類號：TS251.94 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2013）11-0033-04

隨著經(jīng)濟(jì)與社會的發(fā)展，食品安全問題越來越突出，其中防腐劑是引起食品安全性問題的來源之一?；瘜W(xué)合成防腐劑在具有較高防腐保鮮效果的同時又往往給人類健康帶來不良的影響，甚至?xí)霈F(xiàn)致癌、致畸、致突變等危害。在食品領(lǐng)域，抑菌肽的安全無毒害作用的優(yōu)勢使得它具有作為天然食品防腐劑的潛在應(yīng)用價值[1-2]。在食品中添加抑菌肽，能改善食品抗菌性能且對消費者是安全的。

目前，抑菌肽的制備方法主要有以下幾種：從動植物體內(nèi)直接提取法、化學(xué)合成法、基因工程法、酶解法[3-8]。抑菌肽作為天然食品防腐劑的一種，是高效安全的食品添加劑。隨著人們對食品安全、要求的不斷提高，在食品中添加天然防腐劑必然成為一種發(fā)展趨勢，也將成為食品防腐領(lǐng)域的研究熱點[9-10]。

2012年，我國肉類總產(chǎn)量為8384萬噸，畜禽骨產(chǎn)量大約能達(dá)到2500萬噸，從目前畜骨的利用來看，利用率不足20%，造成了嚴(yán)重的浪費[11-12]。通過酶解牛骨膠原蛋白產(chǎn)生抑菌肽，使得畜禽骨得到有效利用，在帶來良好經(jīng)濟(jì)效益的同時避免了環(huán)境污染[13-15]。本實驗為抑菌肽的研究提供依據(jù)，從而開發(fā)出新型天然防腐保鮮劑，降低食品中化學(xué)合成防腐劑的用量，有利于食品安全和人們的身體健康。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛骨 市購；中性蛋白酶（6.2×104U/g） 諾維信（中國）投資有限公司；瓊脂 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；營養(yǎng)肉湯 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Sephadex G-25葡聚糖凝膠 美國Pharmacia公司；乙腈（色譜純） 美國Fisher公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

骨粉碎機(jī) 河北廊坊惠友機(jī)械公司；BSZ-100-LCD自動部分收集器、HD-21-88紫外檢測儀 上海琪特分析儀器有限公司；F1-45型恒溫培養(yǎng)箱、G154DWS濕熱滅菌鍋 日本三洋公司；LGJ-30真空冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；二級生物安全柜 新加坡藝思高科技有限公司；中空纖維超濾組件 北京旭邦膜設(shè)備有限責(zé)任公司；高效液相色譜儀 美國Waters公司；ABI 4700基質(zhì)輔助激光解析離子化串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀 美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 牛骨酶解液的制備

按照文獻(xiàn)[16]的方法利用中性蛋白酶進(jìn)行酶解，得到的酶解液在90℃、10min的條件下使酶失活。并在4℃、8000r/min的條件下離心10min，收集上清液，真空冷凍干燥成粉備用。

1.3.2 酶解液超濾分離

采用中空纖維超濾組件，選取截留分子質(zhì)量為10kD的濾膜對牛骨膠原蛋白的酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離，將分子質(zhì)量大于10kD的物質(zhì)和分子質(zhì)量小于10kD的組分分別冷凍干燥備用。

1.3.3 多肽的凝膠層析分離

經(jīng)超濾后有抑菌活性的多肽組分用Sephadex G-25凝膠層析色譜裝置進(jìn)行分離，洗脫液為超純水；紫外檢測儀參數(shù)：靈敏度設(shè)0.1?，λ=220nm；玻璃柱大小2.6cm×40cm；上樣量2mL；上樣液質(zhì)量濃度100mg/mL；蠕動泵流速1.0mL/min。

1.3.4 多肽抑菌率測定

本實驗測定酶解液分離的各組分對大腸桿菌的抑菌活性，以抑菌率表示。將菌種培養(yǎng)至對數(shù)生長期并用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，調(diào)整濃度為1.0×103CFU/mL，吸取細(xì)菌培養(yǎng)液200μL至無菌的1.5mL離心管中，同時設(shè)對照。實驗管中加入800μL經(jīng)0.45μm無菌濾膜過濾的濃度為10mg/mL的多肽；對照管中加入800μL無菌生理鹽水。兩管同時于37℃條件下振蕩培養(yǎng)，1h后取200μL溶液涂布于計數(shù)平板上，37℃培養(yǎng)24h，計算平板上的菌落總數(shù)。抑菌率的計算公式如下：

抑菌率/% =（N對照―N實驗）/N對照×100

式中：N對照為對照管細(xì)菌菌落總數(shù)；N實驗為實驗管細(xì)菌菌落總數(shù)。

1.3.5 抑菌肽組分的反向高效液相色譜測定

將凝膠層析分離得到的抑菌肽溶液經(jīng)0.45μm的水相濾膜過濾，然后進(jìn)樣到液相色譜儀器中分析。分析條件：進(jìn)樣體積20μL；流速0.8mL/min；洗脫液：A 液為超純水；B 液為乙腈（色譜純）；梯度洗脫：B液，0～10min，2%～10%、10～45min，10%～100%；柱溫25℃；檢測波長220nm。

1.3.6 抑菌肽組分的基質(zhì)輔助激光解析/離子化串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀測定

基質(zhì)輔助激光解析/離子化串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-TOF-MS）儀器操作條件：脈沖氮激光（355nm）離子解析電離源；質(zhì)譜信號為多次累加掃描；質(zhì)譜掃描范圍： m/z500～5000；采用正離子反射模式檢測[17]；樣品分析前用標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物對MALDI-TOF-TOF-MS進(jìn)行校正。

基質(zhì)制備：選擇α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid，CHCA）作為基質(zhì)，用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的三氟乙酸加入超純水后和乙腈溶液混合（7：3，m/m），將CHCA加入混合液配制成質(zhì)量濃度為5g/L的基質(zhì)溶液，基質(zhì)溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

樣品制備：樣品稀釋到合適的濃度，取0.8μL點靶，自然風(fēng)干再加入0.8μL CHCA基質(zhì)溶液點靶，自然風(fēng)干后進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾分離組分的抑菌活性分析

將酶解后凍干的多肽組分用適量水溶解，經(jīng)1.3.2節(jié)的方法進(jìn)行超濾分離，將分離得到的各組分凍干后，配制20mg/mL多肽溶液，按照1.3.4節(jié)抑菌方法測定各組分對大腸桿菌的抑菌能力，如表1所示，大于10kD分子質(zhì)量的組分沒有抑菌能力，這可能是因為多肽的分子質(zhì)量較大，具有獨特的空間結(jié)構(gòu)，不易與細(xì)菌發(fā)生作用；小于10kD分子質(zhì)量的組分具有較好的抑菌活性，對大腸桿菌的抑菌率為93.61%。

2.2 凝膠分離組分的抑菌活性分析

為得到牛骨膠原蛋白酶解液凝膠層析的洗脫峰，選定紫外波段的220nm作為測定波長。按照1.3.3節(jié)的分離方法將小于10kD分子質(zhì)量的超濾組分凍干后配制為合適的濃度進(jìn)行凝膠層析。由圖1可知，小于10kD分子質(zhì)量的超濾組分經(jīng)Sephadex G-25凝膠分離后，得到4個峰組分。將分離得到的各峰組分收集、冷凍干燥成粉。

配制質(zhì)量濃度為10mg/mL的峰Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組分溶液按照1.3.4節(jié)的方法進(jìn)行抑菌實驗。由圖2可知，四種組分對大腸桿菌的抑菌能力有很大差別，其中，峰Ⅰ組分的抑菌能力最強(qiáng)，37℃培養(yǎng)24h后，沒有菌落形成；峰Ⅳ組分具有較好的抑菌效果，抑菌率為91.39%，峰Ⅱ和峰Ⅲ組分幾乎不具有抑菌能力。

2.3 抑菌肽組分的反相高效液相色譜法分析

將經(jīng)凝膠柱Sephadex G-25層析分離得到的具有較強(qiáng)抑菌活性的峰Ⅰ和峰Ⅳ組分配制成合適的溶液，經(jīng)0.45μm的水相濾膜過濾，進(jìn)樣到高效液相色譜儀中用反相高效液相色譜法（reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）分析。由圖3可知，峰Ⅰ組分中含有較多的多肽成分，出峰時間集中在12～20min，在保留時間5.058min時有一較大的吸收峰，此時的流動相水分占的比例較大，可判定此物質(zhì)的極性較強(qiáng)。由圖4可知，峰Ⅳ組分中含有的多肽成分較少，主要集中在35～40min之間被檢測到。保留時間36.970min時的吸收峰最高，此時流動相乙腈占的比例大，可判定此物質(zhì)的極性較弱。

采用MALDI-TOF-TOF-MS法測定具有抑菌效果的峰Ⅰ和峰Ⅳ組分，因MALDI-TOF-TOF-MS產(chǎn)生的是單電荷的離子，一般為[M+H]+峰，因此可根據(jù)質(zhì)譜圖計算峰組分中多肽的分子質(zhì)量。經(jīng)一級質(zhì)譜分析，峰Ⅰ組分中多肽的分子質(zhì)量集中在850～1550D之間，如圖5所示，其中信號較強(qiáng)的母離子為m/z 1361.67、1304.65、1122.56和911.45。峰Ⅳ組分中多肽的分子質(zhì)量集中在700～900D之間，如圖6所示，其中信號較強(qiáng)的母離子為m/z 877.04、775.34、728.38、861.06和730.22。經(jīng)質(zhì)譜圖檢測到的信號驗證了RP-HPLC分析的結(jié)果：峰Ⅰ組分的成分多，而峰Ⅳ組分的成分較少。

3 結(jié) 論

牛骨膠原蛋白經(jīng)中性蛋白酶酶解、超濾分離后，得到的小于10kD分子質(zhì)量的組分具有較好的抑菌活性，在20mg/mL的濃度下對大腸桿菌抑菌率為93.61%。小于10kD分子質(zhì)量的組分經(jīng)Sephadex G-25分離后，峰Ⅰ組分具有最高的抑菌活性，在10mg/mL的質(zhì)量濃度下，培養(yǎng)基中沒有大腸桿菌的菌落形成，峰Ⅳ組分也具有較好的抑菌活性，抑菌率為91.39%。經(jīng)RP-HPLC和MALDI-TOF-TOF-MS分析，峰Ⅰ組分中含有的多肽種類多，分子質(zhì)量集中在850～1550D之間。峰Ⅳ組分含有的多肽種類較少，分子質(zhì)量集中在700～900D之間。

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