夏新武 王武 陳從貴等

摘 要：探討陳皮對烘烤牛肉干中雜環(huán)胺生成及牛肉干質(zhì)量損失率、色差、感官指標的影響。陳皮的總酚物質(zhì)含量及抗氧化能力分別通過福林-酚法及DPPH法測定，牛肉干中雜環(huán)胺含量利用高壓液相色譜法測定。在沒有經(jīng)過陳皮水提物腌制處理牛肉干中檢測出2-氨基-3，8-二甲基咪唑并[4，5-F]喹喔啉（MeIQx）、2-氨基-3，4，8-三甲基咪唑并[4，5-F]喹喔啉（4，8DiMeIQx）、9H-吡啶并[3，4-B]吲哚（Norharman）、1-甲基-9H-吡啶并[3，4-B]吲哚（Harman）和2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑并[4，5-B]吡啶（PhIP），總含量為44.01ng/g。160mg/mL的陳皮水提物可顯著降低MeIQx（34.3%），PhIP（96.5%），但是顯著增加了Norharman（32.4%）；且陳皮提取液濃度越高、腌制時間越長，其對牛肉干中雜環(huán)胺含量的影響越大；陳皮腌制處理對牛肉干質(zhì)量損失率沒有顯著影響，而色澤隨著陳皮濃度的升高而明顯變淡；感官評價表明經(jīng)過陳皮腌制的牛肉干在顏色及風(fēng)味感官品質(zhì)上無不良影響。因此，陳皮提取物腌制是一種較好的抑制烘烤牛肉干中雜環(huán)胺的方法。

關(guān)鍵詞：陳皮；總酚含量；抗氧化能力；雜環(huán)胺；牛肉干

牛肉和魚肉中發(fā)現(xiàn)雜環(huán)胺[1]，此后，烹飪過程中有害物質(zhì)的形成及其對人體健康影響方面的研究得到了廣泛關(guān)注。飲食過程中雜環(huán)胺的攝入會增加包括直腸、胃、肺、胰腺、乳腺和前列腺部位癌變的風(fēng)險[2-3]。國際癌癥研究中心將2-氨基-3，8-二甲基咪唑并[4，5-F]喹喔啉（MeIQx）和2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑并[4，5-B]吡啶（PhIP）等雜環(huán)胺列為可能致癌物，將2-氨基-3-甲基咪唑并[4，5-F]喹啉（IQ）列為可能性很大的致癌物[4]。迄今為止，已經(jīng)有超過30種雜環(huán)胺被從不同的烹飪?nèi)庵破分蟹蛛x鑒定出來。

根據(jù)生成途徑的不同，雜環(huán)胺可分為氨基咪唑氮與氨基咔啉兩類，前者主要是氨基酸、葡萄糖、肌酸和肌酸酐在熱條件下通過美拉德反應(yīng)形成；后者中除了9H-吡啶并[3，4-B]吲哚（Norharman）和1-甲基-9H-吡啶并[3，4-B]吲哚（Harman）外都在300℃條件下由氨基酸或蛋白質(zhì)熱裂解形成[5-6]。美拉德反應(yīng)過程中的自由基反應(yīng)參與了雜環(huán)胺的生成，人工合成及天然抗氧化成分物質(zhì)被證明可以抑制雜環(huán)胺的生成。電子自旋共振光譜證明了抗氧化物質(zhì)對雜環(huán)胺生成過程中吡嗪陽離子自由基的清除作用[7]。

研究表明，富含抗氧化物質(zhì)的天然植物提取物對抑制加工肉制品中雜環(huán)胺的生成有明顯效果。Gibis等[8]研究了葡萄籽和迷迭香提取物腌制對煎牛肉餅中雜環(huán)胺的抑制效果，結(jié)果表明，經(jīng)過提取物的腌制過程，MeIQx和PhIP 的抑制率可分別達到57%和90%。Quelhas等[9]研究了綠茶腌漬液對平底鍋煎烤牛肉中2-氨基-9H-吡啶并[2，3-B]吲哚（AαC）、2-氨基-3，4，8-三甲基咪唑并[4，5-F]喹喔啉（4，8DiMeIQx）、MeIQx、PhIP四種雜環(huán)胺的生成影響，結(jié)果表明，PhIP和AαC的濃度明顯下降（P<0.05）；4，8DiMeIQx，MeIQx的濃度無明顯變化，并且在處理樣品中無不良感官評價。

陳皮富含抗氧化類多酚物質(zhì)，現(xiàn)代技術(shù)已經(jīng)檢測到其中含有橙皮苷、柚皮苷、川陳皮素、橘皮素、功能性多糖等物質(zhì)[10-11]，且有研究表明其具有抗脂質(zhì)氧化與清除自由基作用[12-13]。陳皮也因其特有的芳香性風(fēng)味性質(zhì)，被應(yīng)用到多種食品加工過程中。對于陳皮水提物對烘烤牛肉干中雜環(huán)胺種類和含量的影響未見報道。本實驗考查陳皮水提液腌漬處理對烘烤牛肉干中6種不同雜環(huán)胺含量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

恒都牛后腿肉、新會陳皮 市購。

雜環(huán)胺標品：2-氨基-3-甲基咪唑并[4，5-F]喹啉（IQ）、2-氨基-3，8-二甲基咪唑并[4，5-F]喹喔啉（MeIQx）、2-氨基-3，4，8-三甲基咪唑并[4，5-F] 喹喔啉（4，8DiMeIQx）、9H-吡啶并[3，4-B]吲哚（Norharman）、1-甲基-9H-吡啶并[3，4-B]吲哚（Harman）、2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑并[4，5-B]吡啶（PhIP） 加拿大Toronto Research Chemicals公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （DPPH） 美國Sigma-Aldrich公司。

沒食子酸標準品為色譜純；甲醇、乙腈為色譜級；醋酸胺、冰醋酸、二氯甲烷、氨水等皆為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Extrelut NT20空柱 美國Varian公司；硅藻土、Bond Elut-PRS柱（500mg/3mL）、Bond Elut-C18柱（500mg/3mL，100mg/1mL）、Agilent1100 高相液相色譜儀、G1315A紫外檢測器、G1312A熒光檢測器 美國安捷倫公司；TSK gel ODS-80TM 色譜柱（250×4.6mm，5μm，80A） 日本Tokyo公司；DC-12固相萃取裝置 天津東康科技有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；T-J-200高速分散均質(zhì)機 上海標本模型廠；CT14 RD臺式高速冷凍離心機 上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；WB-2000IXA全自動測色色差儀 北京康光儀器有限公司；電子天平 美國Satorius公司；752N紫外可見分光光度計 上海精科儀器有限公司；遠紅外高級食品烤箱 瑞安市成業(yè)食品機械廠；LG-04高速中藥粉碎機 瑞安市百信藥機器械廠。

1.3 方法

1.3.1 陳皮腌漬液制備

陳皮原料經(jīng)過粉碎后過60目篩，分別取4、7、10、13、16g 陳皮粉末置于250mL錐形瓶中，加入100mL體積分數(shù)為10%的乙醇水溶液，在80℃水浴條件下提取30min后超聲提取5min，再放入80℃水浴條件下提取30min。制備好的腌制液保存待用。另將制備好的質(zhì)量濃度為40mg/mL陳皮腌制液在4000r/min條件下離心5min，取其上清液用于陳皮總酚含量及抗氧化能力的測定。

1.3.2 陳皮總酚含量測定

陳皮總酚含量測定采用福林-酚法[14]且以沒食子酸當(dāng)量表示，以每克陳皮中的沒食子酸當(dāng)量（galic acid equivalent，GAE）的毫克數(shù)計（mg GAE/g）。取1mL適度稀釋后的陳皮水提物于10mL試管中，加入福林-酚試劑2.5mL并搖勻反應(yīng)5min，之后再加入2mL飽和Na2CO3溶液并用蒸餾水定容至10mL，在室溫條件下（25℃）反應(yīng)2h后于760nm波長處測定吸光度。以蒸餾水做對照，以沒食子酸溶液為標準，繪制標準曲線，結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量表示。每個樣品平行測定3次，取平均值。

1.3.3 陳皮抗氧化能力測定

陳皮抗氧化能力通過1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl） hydrazyl，DPPH）自由基清除能力表示，參照Singh等[15]的方法作輕微改進，將40mg/mL陳皮水提物分別逐次稀釋到8、1.6、0.32、0.064、0.0128、2.56×10-3、5.12×10-4、1.02×10-4mg/mL。分別取各質(zhì)量濃度的水提物1.5mL、蒸餾水0.5mL、2×10-4mol/L DPPH溶液2mL混于10mL試管中，混勻后在避光下反應(yīng)30min。以同樣條件下添加2mL蒸餾水的為對照組，在517nm下測定吸光度，以L-抗壞血酸（VC）作為陽性對照。每個樣品平行測定3次，取平均值，按以下公式計算DPPH自由基清除率：

DPPH+清除率/%=[（A1-A2）/A1]×100

式中：A1為對照組吸光度；A2為樣品吸光度。

1.3.4 質(zhì)量損失率和色差測定

陳皮腌制牛肉干的質(zhì)量損失率分別由牛肉干烘烤測的質(zhì)量所得。在牛肉干烤制之前后分別測定牛肉干的質(zhì)量以及色度（L值、a值、b值），烤制前注意牛肉干上腌制液的瀝干，平行3次實驗，取平均值。

1.3.5 感官品質(zhì)測定

對陳皮腌制處理烘烤牛肉干的感官指標進行測定，選擇10名專業(yè)的食品專業(yè)評分員對樣品進行顏色和風(fēng)味的評價?？疾祛伾惋L(fēng)味2個指標，各指標采用5分制。1～2分代表顏色較淺；3分代表顏色一般；4～5分代表顏色較深。對于風(fēng)味：1～2分代表無明顯陳皮風(fēng)味，3分代表有輕微陳皮風(fēng)味，4～5分代表有明顯陳皮風(fēng)味。最后以2個指標之和作為總分。

1.3.6 雜環(huán)胺含量測定

采用高效液相色譜法測定樣品中的雜環(huán)胺，參照Gross 等[16]和萬可慧等[17]的方法并作輕微改進，樣品經(jīng)均質(zhì)機均質(zhì)后需經(jīng)過高速冷凍離心機在10000r/min條件離心20min后取上層液體再與硅藻土混合，轉(zhuǎn)入NT20空柱中并淋洗至PRS柱以及C18柱后收集。

1.4 前處理

1.4.1 陳皮提取液質(zhì)量濃度對牛肉干質(zhì)量損失率和色差的影響

選取4cm×2cm×0.5cm質(zhì)量約19g的肉干分別于40、70、100、130、160mg/mL的陳皮提取液中腌制4h，并且在烤制前后10min測定牛肉干的質(zhì)量與色度。

1.4.2 陳皮提取液質(zhì)量濃度對牛肉干感官品質(zhì)的影響

選取4cm×2cm×0.5cm質(zhì)量約19g的肉干分別于40、 70、100、130、160mg/mL的陳皮提取液中腌制4h，在烤制后測定其感官品質(zhì)。

1.4.3 陳皮提取液質(zhì)量濃度對雜環(huán)胺含量的影響

將牛肉切成4cm×2cm×0.5cm質(zhì)量約19g的肉干，分別將牛肉干置于配好備用的40、70、100、130、160mg/mL的陳皮提取液中腌制4h，同時以只加100mL蒸餾水的樣品作為對照。腌制結(jié)束后將牛肉干放在錫箔紙上于遠紅外食品烤箱中在200℃烘烤10min。烘烤結(jié)束完成指標檢測后將牛肉干袋裝密封于-20℃下保藏，平行3次取平均值。

1.4.4 陳皮腌制時間對雜環(huán)胺含量的影響

取4cm×2cm×0.5cm質(zhì)量約19g的肉干分別置于100mg/mL陳皮腌制液中浸泡1、2、4、8、16h，以不在100mg/mL陳皮腌制液中腌制的牛肉干為對照。同樣結(jié)束后將牛肉干放在錫箔紙上于遠紅外食品烤箱中在200℃下烘烤10min。烘烤結(jié)束完成指標檢測后將牛肉干袋裝密封于―20℃條件下保藏，平行3次，取平均值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行平均值、方差、差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 陳皮提取物的總酚含量及抗氧化能力

2.2 陳皮提取液對牛肉干質(zhì)量損失率和色差的影響

時差異最顯著。烘烤肉制品顏色通常也是作為一個衡量肉制品烘烤程度的指標，但5組處理組牛肉干質(zhì)量損失率無顯著性差異表明其烘烤程度也沒有顯著性差異，其原因可能是陳皮腌漬液本身攜帶的顏色作用在牛肉干上引起的現(xiàn)象。

加工肉制品中雜環(huán)胺的含量受到加工條件、肉體種類、肉體部位等因素的多重影響，例如加工溫度、加工時間與肉制品中雜環(huán)胺的含量有重要聯(lián)系。圖2中質(zhì)量損失率的變化顯示不同濃度陳皮腌制液處理下的牛肉干的烘烤程度無顯著差異，可認為牛肉干中雜環(huán)胺含量沒有受烘烤程度的影響。

2.3 陳皮提取液對牛肉干感官品質(zhì)的影響

2.4 陳皮提取液質(zhì)量濃度對雜環(huán)胺含量的影響

在對照組中檢測到了5種雜環(huán)胺且總含量達到了44.01ng/g。其檢測結(jié)果與萬可慧等 [17]對市售牛肉干中雜環(huán)胺的含量的結(jié)果有比較性。在40mg/mL陳皮提取液處理組樣品中檢測到PhIP含量與對照組有顯著差異（P<0.05），其含量由對照組中（8.08±0.35）ng/g下降到（1.66±0.45）ng/g，抑制率達到79.5%。其余4種雜環(huán)胺含量并未發(fā)現(xiàn)顯著變化。隨著陳皮提取液濃度的提高，MeIQx與Norharman的含量在質(zhì)量濃度為130mg/mL時出現(xiàn)顯著變化（P<0.05），其中Norharman的含量呈增加趨勢，并在質(zhì)量濃度為160mg/mL時變化更為顯著；MeIQx含量由（8.16±0.55）ng/g下降到（5.36±0.10）ng/g，抑制率達到了34.3%；PhIP的抑制率達到了96.5%。

Britt等[18]研究了在烤牛肉餅中添加櫻桃組織抑制雜環(huán)胺的效果，結(jié)果顯示，PhIP的含量分別被蒙莫朗西（Montmoreny）和巴拉頓（Balaton）兩種不同的櫻桃組織分別抑制了93%和87%。Gibis[19]研究了含有大蒜、洋蔥和檸檬汁的腌漬液對煎烤牛肉餅中雜環(huán)胺生成的影響，結(jié)果表明，當(dāng)大蒜的添加量為20g/100g時，牛肉餅中MeIQx的質(zhì)量分數(shù)降低70%。姚瑤等[20]在研究中發(fā)現(xiàn)香辛料在抑制雜環(huán)胺形成的同時也會促進另外幾種雜環(huán)胺的產(chǎn)生。與前人研究結(jié)果不同的是，實驗中Norharman的含量明顯增加32.4%。Yaylayan[21]等研究了Norharman的生成機制，發(fā)現(xiàn)色氨酸的重排產(chǎn)物首先以呋喃糖的形式進行脫水反應(yīng)，隨后在環(huán)氧孤對電子的輔助下進行β-消去反應(yīng)請核實從而形成一個共軛的氧鎓離子。這個反應(yīng)中間體可以通過脫水形成一個擴展的共軛體系從而進一步穩(wěn)定自身，或者通過C—C鍵分裂而產(chǎn)生一個中性的呋喃衍生物和一個亞胺鎓陽離子，隨后中間體進行分子內(nèi)親核取代反應(yīng)形成β-咔啉。

由表1可知，陳皮提取液質(zhì)量濃度為100mg/mL時，MeIQx與Norharman的含量均未被發(fā)現(xiàn)有顯著性變化（P>0.05），但在質(zhì)量濃度為130mg/mL時發(fā)現(xiàn)有顯著性變化（P<0.05）。因此考查在陳皮提取液質(zhì)量濃度為100mg/mL時，腌制時間的長短對牛肉干中雜環(huán)胺含量的影響。

2.5 陳皮提取液腌制時間對雜環(huán)胺含量的影響

在腌制時間為1h時，PhIP含量就有了顯著性的下降，而在1～4h內(nèi)其余4種雜環(huán)胺都未發(fā)現(xiàn)顯著性變化。當(dāng)腌制時間為8h時，MeIQx的含量發(fā)生顯著性變化，而Norharman的含量在腌制時間為16h時才出現(xiàn)顯著性變化。值得注意的是，在腌制時間為16h，提取液質(zhì)量濃度為100mg/mL時，PhIP的含量達到了99%的抑制。Quelhas等[22]考查了綠茶腌制時間與綠茶對雜環(huán)胺效果之間的相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者之間有顯著相關(guān)性。實驗中同時考查了陳皮提取液濃度和陳皮腌制時間對牛肉干中雜環(huán)胺含量的影響，結(jié)果表明二者都能夠促進陳皮提取液的影響效果。

3 結(jié) 論

陳皮提取物具有良好的抗氧化能力。在陳皮腌制處理烘烤牛肉干中檢測出了MeIQx、4，8DiMeIQx、Norharman、Harman和PhIP共5種雜環(huán)胺，并發(fā)現(xiàn)其能顯著抑制（P<0.05）烘烤牛肉干中MeIQx（34.3%）和PhIP（96.5%）的含量并顯著增加了Norharman（32.4%）的含量，但是在總體上抑制了雜環(huán)胺的生成。陳皮提取物的濃度越高、腌制的時間越長，雜環(huán)胺的變化越明顯。經(jīng)陳皮處理過的牛肉干在質(zhì)量損失率上沒有發(fā)生顯著變化（P>0.05）；而色澤隨著陳皮提取液質(zhì)量濃度的升高而明顯變淡；經(jīng)過陳皮腌制的牛肉干在顏色及風(fēng)味感官品質(zhì)上無不良影響；陳皮提取物除了多酚類抗氧化物質(zhì)外還有許多其他物質(zhì)，且由自由基參與的雜環(huán)胺形成過程只是一部分，對肉制品中雜環(huán)胺的抑制還有待進一步研究；綜上所述，陳皮提取物腌制是一種較好的抑制烘烤牛肉干中雜環(huán)胺的方法。

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