趙冰 李素 戚等

摘 要：采用索氏提取-固相萃取-高效液相色譜法檢測清真牛肉香腸中的苯并（a）芘含量，結果表明，該方法操作簡單，檢測結果準確，可信度高，回收率可以達到91%以上，特別是對于油脂含量較高的食品具有良好的效果，可以推廣到其他肉制品中苯并（a）芘的檢測。

關鍵詞：索氏提取；苯并（a）芘；高效液相色譜；固相萃取

中圖分類號：TS251.1 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2013）11-0030-03

煙熏肉制品香腸色澤金黃、風味獨特，具有濃郁的煙熏風味，同時具有良好的貯藏性和較長的貨架期，但是在肉制品的煙熏過程中，由于煙熏木屑的不完全燃燒或蛋白質和脂肪高溫熱解會生成多環(huán)芳烴類物質，這些物質具有致癌性[1-2]。其中苯并（a）芘是具有代表性的物質，我國對肉制品中苯并（a）芘的限量標準是不超過5?g/kg[3]，

歐盟根據(jù)最新修訂的標準則是根據(jù)苯并（a）芘、苯并（a）蒽、苯并（β）熒蒽、chrysene四種物質的總量不高于30.0μg/kg（自2012年9月日至2014年8月31日），不高于12.0μg/kg（自2014年9月1日起）[4]。

目前，我國肉制品中苯并（a）芘的檢測方法主要有兩種，第一是目前的現(xiàn)行國標GB/T5009.27—2003《食品中苯并（a）芘的測定》[5]，這種方法是試樣經(jīng)過皂化后用有機溶劑提取，在經(jīng)過液液萃取和柱層析，最后通過熒光分光光度計或目測法進行檢測，這是目前最通用的苯并（a）芘檢測方法，但是該方法步驟繁瑣，而且需要消耗大量的有機溶劑；通過熒光分光光度計或目測法進行檢測，檢測結果的準確性有待改進；是農業(yè)行標NY/T 1666—2008《肉制品中苯并（a）芘的測定：高效液相色譜法》[6]，這種方法通過多步驟的液液萃取和反萃取收集肉制品中的苯并（a）芘，最后通過高效液相色譜儀進行檢測，該方法相對于GB/T 5009.27—2003《食品中苯并（a）芘的測定》步驟簡單，而且采用高效液相色譜法進行檢測，準確度較高，但是由于在液液萃取和反萃取中，會損失一定的液體，同時，如果脂肪含量較高，最終樣品中苯并（a）芘的檢測結果會有較大的影響。

本實驗以煙熏清真牛肉香腸為對象，研究一種新型的肉制品中苯并（a）芘的檢測方法，該方法采用索氏提取-固相萃取-高效液相色譜法進行前處理和檢測，步驟簡單，檢測結果準確，為目前肉制品中苯并（a）芘的檢測提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肉 市售；大豆蛋白、復合磷酸鹽、卡拉膠、食鹽、蔗糖等輔料購于超市。

正己烷、無水乙醚 國藥集團化學試劑北京有限公司；煙熏木屑 北京美添前景科技有限公司；苯并（a）芘標準品 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

Welchom BaP苯并芘專用固相萃取小柱 （22g/60mL）、WelchomC18E固相萃取小柱（200mg/3mL） 上海月旭科技公司；型號高效液相色譜儀-熒光檢測器 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 煙熏清真牛肉香腸加工

以牛肉為原料，將其用絞肉機絞碎，通過攪拌機使其與輔料混勻，使用膠原蛋白腸衣灌腸、打結，在煙熏爐中50℃干燥30min，然后煙熏40min，溫度50℃。將煙熏后的香腸在90℃蒸煮20min，得到的產(chǎn)品冷卻后真空包裝，最后進行巴氏殺菌，產(chǎn)品置于冷庫中備用。

1.3.2 苯并（a）芘標準曲線的繪制

采用外標法進行定量，配制以甲醇為溶劑質量濃度為150ng/mL的苯并（a）芘標準溶液，然后分別取0、2、4、6、8、10mL質量濃度為150ng/mL的苯并（a）芘標準溶液，定容至10mL，配制成質量濃度分別為0、5、10、15、20ng/mL的標準溶液，再按照上述的色譜條件測定峰面積，以6種標準品的質量濃度為橫坐標（x，ng/mL），對應的峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線為y = 83748x+39046（R? = 0.999），說明苯并（a）芘在質量濃度0～25ng/mL的范圍內具有良好的線性關系。

1.3.3 色譜條件[6]

色譜柱：C18柱（4.6mm×250mm，5?m）；流動相：乙腈-水（體積比88：12）；流速1.2mL/min；熒光檢測器：激發(fā)波長384nm，發(fā)射波長406nm；柱溫30℃；進樣量10?L。

1.3.4 固相萃取柱的選擇

根據(jù)苯并（a）芘的極性特點，選用WelchromC18E與Welchrom BaP（氧化鋁）2種不同固定相填料對苯并（a）芘進行富集處理，采用空白加標檢測苯并（a）芘回收率的方法進行比較?？瞻字斜讲ⅲ╝）芘質量濃度分別為5ng/mL和20ng/mL。

1.3.5 煙熏清真牛肉香腸中苯并（a）芘的提取

按照國標GB/T 9695.19—2008《肉與肉制品取樣方法》[7]取樣檢測。由于單個產(chǎn)品質量小于500g，因此選取產(chǎn)品5件，在5～10℃的環(huán)境中將樣品粉碎成肉糜狀，混勻。準確稱取5g樣品，在40℃索氏提取，回流6h，然后將乙醚與脂肪的混合液40℃旋轉蒸發(fā)濃縮至干，分2次加入10mL的正己烷，轉移至15mL的離心管中，漩渦振蕩充分混勻，形成樣品提取液，備用[8-10]。然后將固相萃取小柱裝在固相萃取儀上，加入約30mL正己烷活化，流出液棄用；將之前的樣品提取液加入到固相萃取小柱中，然后分4次加入正己烷洗脫，收集洗脫液于茄型瓶中，整個過程在常壓下進行，自然洗脫；40℃旋轉蒸發(fā)濃縮至干，用2mL乙腈定容，過0.45μm微孔濾膜過濾，采用高效液相色譜法分析[11-13]。

1.3.6 方法的精密度和回收率測定

在已知苯并（a）芘含量的煙熏清真牛肉香腸中分別添加低質量濃度到高質量濃度的苯并（a）芘標準品，進行苯并（a）芘的回收率實驗，2個添加水平分別為5ng/mL和20ng/mL，每個添加實驗平行測定6次[14]。

2 結果與分析

2.1 苯并（a）芘的標準溶液高效液相色譜色譜圖

2.3 固相萃取柱的選擇

Welchrom C18E的富集效果為77%以上，也具有較好的富集效果，在多環(huán)芳烴類物質的固相萃取富集實驗中，Welchrom C18E具有較好的富集效果[15-17]，這也是選其作為對比的原因。Welchrom BaP固相萃取柱對苯并（a）芘具有更高的回收率，可以達到87.6%以上，對苯并（a）芘的富集效果非常顯著，可以很好的滿足苯并（a）芘檢測的要求。Welchrom BaP固相萃取柱主要以氧化鋁為固相填料，并進行特殊處理，使其對苯并芘具有非常優(yōu)秀的富集效果。因此，后續(xù)的實驗采用Welchrom BaP固相萃取小柱進行樣品的富集實驗。

2.3 煙熏清真牛肉香腸中苯并（a）芘的檢測

Fig.2 HPLC chromatogram of benzo[a]pyrene in sample

對煙熏清真牛肉香腸中的苯并（a）芘含量進行檢測，結果如圖3所示，可以看出大約10.8min左右有一個明顯的吸收峰，與標準曲線對照可確定為苯并（a）芘，由標準曲線可以計算出樣品中苯并（a）芘的質量濃度為9.95ng/mL，經(jīng)過計算可知，煙熏清真牛肉香腸中苯并（a）芘的含量為1.99?g/kg。

2.4 精密度和回收率分析

3 結 論

本實驗采用索氏提取-固相萃取-高效液相色譜法檢測煙熏清真牛肉香腸中的苯并（a）芘，該方法操作簡單，檢測結果準確，可信度高，特別是對于油脂含量較高的食品具有良好的效果[18-20]，由于樣品中含有脂肪和瘦肉，而苯并（a）芘易溶于乙醚，因此通過索氏提取同時提取肉制品中的油脂和苯并（a）芘，再通過固相萃取的方式將油脂中的苯并（a）芘提取出來，進行高效液相色譜檢測，具有良好的檢測效果。

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