劉穎穎　劉世琦　馬桂芹等

摘 要：以大蒜未受精子房為試材，研究基因型、子房發(fā)育時(shí)期、低溫預(yù)處理、短期熱激處理對(duì)大蒜未受精子房愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，在B5+2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA培養(yǎng)基上培養(yǎng)的6個(gè)大蒜品種中，糙蒜品種子房愈傷組織的誘導(dǎo)率最高；開(kāi)花當(dāng)天為最佳誘導(dǎo)時(shí)期；低溫4℃處理4 d誘導(dǎo)效果最佳；35℃熱激處理48 h可顯著提高愈傷組織誘導(dǎo)率，但熱激處理易使材料發(fā)生褐化，褐化率均在60%以上。

關(guān)鍵詞：大蒜；未受精子房；愈傷組織；基因型；溫度

大蒜是中國(guó)傳統(tǒng)出口蔬菜產(chǎn)品，在國(guó)際市場(chǎng)上享有極高信譽(yù)，產(chǎn)品多年暢銷(xiāo)不衰[1，2]。隨著技術(shù)貿(mào)易壁壘的日益顯現(xiàn)，對(duì)大蒜品質(zhì)的要求越來(lái)越高[3]，但由于大蒜多采用無(wú)性方式繁殖，病毒逐代積累，容易導(dǎo)致品種種性退化[4]，為此，采取有效措施盡快培育出適合國(guó)際市場(chǎng)需求的大蒜新品種勢(shì)在必行。

利用作物未受精胚珠或子房進(jìn)行離體培養(yǎng)誘導(dǎo)雌核發(fā)育，可獲得單倍體或雙單倍體植株，進(jìn)而獲得純合系[5]。單倍體可用來(lái)部分固定雜種優(yōu)勢(shì)，擴(kuò)大可利用的基因資源，加快育種進(jìn)程[6]。與花藥培養(yǎng)一樣，利用子房進(jìn)行離體培養(yǎng)誘導(dǎo)雌配子體產(chǎn)生單倍體植株在單倍體育種上具有重要意義[7]。20世紀(jì)70～80年代，Uchimiya等（1971）利用未傳粉的玉米（Zea mays L.）子房和茄子（Solanum melongena L.）胚珠誘導(dǎo)出愈傷組織，并觀察到其中有單倍體細(xì)胞的分裂，表明雌配子體人工誘導(dǎo)單倍體植株是可能的[8]。在蔬菜雌核誘導(dǎo)單倍體的研究中，黃瓜和西葫蘆的未受精胚珠培養(yǎng)技術(shù)已較為成熟[9]。蔥屬植物中已從洋蔥[10～12]、韭菜[13]、百合[14]未授粉子房或胚珠培養(yǎng)出單倍體植株。關(guān)于大蒜未受精胚珠與子房培養(yǎng)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)旨在通過(guò)研究大蒜基因型、子房發(fā)育時(shí)期、溫度等因子對(duì)未受精子房離體培養(yǎng)的影響，優(yōu)化大蒜子房離體培養(yǎng)技術(shù)體系，為建立高效大蒜未受精子房離體培養(yǎng)再生植株技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)大蒜取自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科技創(chuàng)新園。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大蒜未受精子房離體培養(yǎng) 切取田間生長(zhǎng)中后期的蒜薹，流水沖洗1～2 h，75%酒精消毒30 s，無(wú)菌水沖洗2～3次，4%次氯酸鈉消毒35 min，最后用無(wú)菌水沖洗3～5次。切去蒜薹最下端并放入裝有液體MS培養(yǎng)基（含30 g/L蔗糖）的大試管中培養(yǎng)，4～6 d后，無(wú)菌條件下剝除膨大的氣生鱗莖繼續(xù)培養(yǎng)。接種前剝?nèi)セò昙靶廴铮瑢⑸L(zhǎng)良好、大小一致的子房接種到B5+2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中添加30 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂，pH 5.8）中誘導(dǎo)愈傷組織。組培室光照條件為2 600 lx，16 h/d，室溫為（25±2）℃。

1.2.2 基因型的影響 選取糙蒜、二水早、蒲棵、正月早、紅七星、二秀早6個(gè)不同品種的花蕾，在開(kāi)花前2～3 d，剝除花瓣及雄蕊，獲得大蒜子房接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移至光照組培室培養(yǎng)。

1.2.3 子房發(fā)育程度的影響 選取糙蒜、蒲棵、正月早3個(gè)品種的花蕾，分別在開(kāi)花前6～7 d、開(kāi)花前2～3 d、開(kāi)花當(dāng)天將花瓣與雄蕊剝除，獲得大蒜子房并接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移至光照組培室培養(yǎng)。

1.2.4 低溫預(yù)處理的影響 以糙蒜、正月早兩個(gè)品種的花蕾為試材，在開(kāi)花前2～3 d將其移至0～4℃的冰箱中，低溫預(yù)處理0（CK）、1、2、4、6 d，處理結(jié)束后將子房接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移至光照組培室培養(yǎng)。

1.2.5 熱激處理的影響 將糙蒜、正月早兩個(gè)品種的大蒜子房接種后，置于35℃的恒溫培養(yǎng)箱中熱激處理0（CK）、12、24、36、48 h，之后移至光照組培室繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

子房接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，每隔3 d觀察一次，60 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織形成數(shù)。每個(gè)處理重復(fù)3次，每次接種外植體個(gè)數(shù)約為50個(gè)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS 6.55和Excel 2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型對(duì)愈傷組織形成的影響

由表1可知，在本試驗(yàn)供試的6個(gè)材料中，糙蒜、正月早兩個(gè)品種間差異不顯著；紅七星、蒲棵、正月早三個(gè)品種間差異不顯著；二季早、二水早兩個(gè)品種間差異不顯著。其中，子房愈傷組織誘導(dǎo)率最高的為糙蒜，可達(dá)11.11%，二水早最低，為0，二者差異極顯著。說(shuō)明基因型對(duì)大蒜子房愈傷組織誘導(dǎo)率有一定的影響，基因型不同，子房愈傷組織誘導(dǎo)率不同。

2.2 子房不同發(fā)育時(shí)期對(duì)愈傷組織形成的影響

由表2可知，從未受精子房愈傷組織誘導(dǎo)率來(lái)看，3個(gè)品種均以開(kāi)花當(dāng)天為最高，開(kāi)花前6～7 d

為最低，二者差異極顯著。其中糙蒜、蒲棵開(kāi)花當(dāng)天與開(kāi)花前2～3 d的子房愈傷誘導(dǎo)率沒(méi)有顯著差異，但都顯著高于開(kāi)花前6～7 d的子房愈傷組織誘導(dǎo)率；正月早3個(gè)時(shí)期的子房愈傷誘導(dǎo)率之間均有顯著差異。

2.3 不同低溫預(yù)處理時(shí)間對(duì)愈傷組織形成的影響

由表3可知，經(jīng)4℃低溫處理的大蒜未受精子房，在0～4 d內(nèi)，愈傷組織誘導(dǎo)率隨低溫時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，超過(guò)4 d誘導(dǎo)率下降。低溫處理4 d的子房愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到最大，糙蒜和正月早分別為15.65%、11.25%，與不經(jīng)低溫處理的子房愈傷組織誘導(dǎo)率呈極顯著差異。由此可見(jiàn)，低溫處理能顯著提高大蒜未受精子房愈傷組織誘導(dǎo)率。

2.4 不同短期熱激處理時(shí)間對(duì)愈傷組織形成的影響

從表4可以得出，從愈傷組織的誘導(dǎo)率來(lái)看，糙蒜經(jīng)過(guò)35℃處理12、24、36 h的子房愈傷組織誘導(dǎo)率略有提高，但與其它兩個(gè)處理差異不顯著；熱激處理48 h比未經(jīng)熱激處理的子房愈傷組織誘導(dǎo)率顯著提高。正月早經(jīng)熱激處理后誘導(dǎo)率有所提高，其中處理12、24、36 h與未經(jīng)熱激處理的子房愈傷組織誘導(dǎo)率差異不顯著；處理48 h比其它處理的子房愈傷組織誘導(dǎo)率顯著提高。從外植體的褐化程度來(lái)看，未經(jīng)熱激處理與經(jīng)過(guò)熱激處理的外植體之間差異極顯著，兩個(gè)品種未經(jīng)熱激處理的外植體均未發(fā)現(xiàn)褐化現(xiàn)象，經(jīng)過(guò)熱激處理的外植體，隨熱激時(shí)間的增加，褐化率增大，不論熱激處理時(shí)間長(zhǎng)短，褐化率均在60%以上，褐化現(xiàn)象嚴(yán)重。

3 結(jié)論

未受精胚珠或子房離體培養(yǎng)誘導(dǎo)雌核發(fā)育產(chǎn)生單倍體植株是國(guó)內(nèi)外探索的新課題。本研究顯示，大蒜未受精子房離體培養(yǎng)10 d左右子房開(kāi)始膨大，經(jīng)過(guò)50 d左右子房?jī)?nèi)部開(kāi)始形成淡綠色的顆粒狀愈傷組織并脹破子房壁，后愈傷組織逐漸膨大變成淡黃色。影響未受精胚珠與子房離體培養(yǎng)的因素很多，如植物的基因型、外植體的發(fā)育程度、接種前預(yù)處理、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等[15]。

基因型是影響子房離體培養(yǎng)的重要因素之一。不同的基因型胚狀體誘導(dǎo)率差異很大[16]。閻華等在向日葵未受精胚珠培養(yǎng)中觀察到不同品種在培養(yǎng)中的差異十分顯著[17]。朱獻(xiàn)輝研究表明，在辣椒子房培養(yǎng)中不同基因型之間愈傷組織誘導(dǎo)率存在顯著差異[18]。多次研究表明，不同基因型洋蔥的誘導(dǎo)率差異明顯[12，19，20]。在大蒜子房培養(yǎng)中，不同基因型之間也存在較為明顯的差異。一般認(rèn)為，不同基因型之間存在誘導(dǎo)率的差異是受遺傳調(diào)控的影響。

子房發(fā)育時(shí)期對(duì)于誘導(dǎo)愈傷組織起至關(guān)重要的作用。謝冰等對(duì)西葫蘆未受精胚珠離體培養(yǎng)誘導(dǎo)結(jié)果表明，西葫蘆成熟以及接近成熟的胚囊對(duì)人工誘導(dǎo)條件比較敏感，而成熟后的胚囊成員細(xì)胞在離體條件下較難啟動(dòng)分裂[21，22]。陳學(xué)軍等提出開(kāi)花當(dāng)日西葫蘆未受精胚珠活力較高，其愈傷組織誘導(dǎo)率也最高[23]。本試驗(yàn)對(duì)糙蒜、蒲棵、正月早3個(gè)品種研究表明，未受精子房愈傷組織的誘導(dǎo)率與子房發(fā)育程度有關(guān)，開(kāi)花當(dāng)天的子房愈傷組織誘導(dǎo)率最高，分析可能是由于開(kāi)花當(dāng)天子房?jī)?nèi)源激素的濃度較高，利于愈傷組織的誘導(dǎo)。

低溫、高溫等預(yù)處理方式，目的是從生理生化上改變細(xì)胞的生理狀態(tài)、改變其分裂方式和發(fā)育途徑。前人研究表明，對(duì)花蕾或子房進(jìn)行有效的預(yù)處理，能改變胚胎的發(fā)育途徑，促進(jìn)胚狀體及愈傷組織的形成[24]。Gürel等[25]研究表明，低溫處理對(duì)甜菜未受精胚珠離體培養(yǎng)起到明顯的促進(jìn)作用。而Metwally等[26]研究表明，不經(jīng)低溫預(yù)處理的胚珠愈傷誘導(dǎo)率最高。本研究顯示低溫（4℃）處理4 d最利于提高大蒜未受精子房愈傷組織誘導(dǎo)率。由此可見(jiàn)，不同植物的子房培養(yǎng)對(duì)低溫預(yù)處理的反應(yīng)不同。熱激處理對(duì)子房培養(yǎng)有一定的影響。王璐等[5]研究表明，熱激處理有利于提高黃瓜未受精子房培養(yǎng)過(guò)程中的雌核誘導(dǎo)率。郭永強(qiáng)[27]、徐靜[28]在對(duì)西葫蘆未受精胚珠雌核誘導(dǎo)的研究中發(fā)現(xiàn)，35℃黑暗熱激處理5 d對(duì)啟動(dòng)西葫蘆未受精胚珠雌核發(fā)育有效。本試驗(yàn)研究表明，熱激處理可提高大蒜子房愈傷組織誘導(dǎo)率，其中35℃處理48 h誘導(dǎo)率明顯提高，但熱激處理易使材料發(fā)生褐化，且時(shí)間越長(zhǎng)，褐化率越高。分析可能是由于高溫處理提高了外植體中多酚氧化酶的活性，促進(jìn)了多酚物質(zhì)的氧化。因此，通過(guò)熱激處理來(lái)提高大蒜子房愈傷組織誘導(dǎo)率還有待于進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)分析不同因素對(duì)大蒜子房離體培養(yǎng)的影響，優(yōu)化了愈傷組織誘導(dǎo)條件。但對(duì)于各處理下形成的愈傷組織是否能夠分化形成再生植株尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 蘇美瓊， 楊柏崇， 成密紅， 等. 大蒜的功效及綜合利用研究進(jìn)展[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2003， 12（4）： 151-156.

[2] 劉世琦， 付 鏞， 王冰林. 大蒜二次生長(zhǎng)形成機(jī)理研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2006， 1： 39-42.

[3] 劉世琦. 加入 WTO 對(duì)中國(guó)大蒜產(chǎn)業(yè)的影響[J]. 長(zhǎng)江蔬菜， 2003，2：5-7.

[4] 于文艷， 劉世琦， 梁慶玲， 等. 大蒜二倍體與四倍體生長(zhǎng)和生理指標(biāo)的比較研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2008， 2：42-44， 65.

[5] 王 璐， 陳小燕， 張 力， 等. 不同因素對(duì)黃瓜未受精子房胚狀體誘導(dǎo)的影響[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2008， 17（4）： 267-270.

[6] 李根英， 孟慶華， 隋新霞， 等. 玉米花粉誘導(dǎo)小麥單倍體的研究進(jìn)展[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2003，1：52-55.

[7] 胡適宜. 被子植物胚胎學(xué)[M]. 北京： 高等教育出版社， 1983，209-211.

[8] Uchimiya H， Kameye T， Takanashi N. In vitro culture of unfertilized ovules in Solanum melongena and ovaries in Zea mays[J]. Jpn. J. Breeding， 1971，21（5）：247-250.

[9] 張 正. 農(nóng)作物單倍體育種研究概況與思考[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2007，5：122-126.

[10]Muren R C. Haploid plant induction from unpollinated ovaries in onion [J]. HortScience， 1989， 24（5）：833-834.

[11]Campion B， Alloni C. Induction of haploid plants in onion （Allium cepa L.） by in vitro culture of unpollinated ovules[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 1990， 20（1）：1-6.

[12]Geoffriau E， Kahane R， Rancillac M. Variation of gynogenesis ability in onion （Allium cepa L.）[J]. Euphytica， 1997， 94（1）： 37-44.

[13]田惠橋， 楊弘遠(yuǎn). 韭菜未傳粉子房培養(yǎng)中單倍體的胚胎發(fā)生和植株再生[J]. 實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)， 1989， 22（2）： 139-147.

[14]谷祝平， 鄭國(guó)倡. 百合未授粉子房的培養(yǎng)及其胚胎學(xué)觀察[J]. 植物學(xué)報(bào)， 1983， 25（1）： 24-27.

[15]伍成厚， 梁承鄴. 被子植物未受精胚珠與子房離體培養(yǎng)的研究進(jìn)展[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)， 2004，12（6）：580-586.

[16]徐文玲， 王翠花， 牟晉華， 等. 大白菜游離小孢子胚狀體誘導(dǎo)影響因素的研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2007，6：8-10.

[17]閻 華， 周 嫦， 楊弘遠(yuǎn).向日葵未受精胚珠培養(yǎng)中各種影響因素的實(shí)驗(yàn)研究[J].武漢植物學(xué)研究， 1988， 6（4）： 319-326.

[18]朱獻(xiàn)輝， 鞏振輝， 王乾宏， 等. 辣椒未受精子房愈傷組織誘導(dǎo)的研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2008， 17（5）： 310-316.

[19]Keller J. Culture of unpollinated ovules， ovaries and flower buds in some species of the genus Alllium and haploid induction via gynogenesis in onion （Alllium cepa L.）[J]. Euphytica，1990，47（3）：241-247.

[20]Bohanec B， Jaksc M， Ihan A， et al. Studies of gynogenesis in onion （Alllium cepa L.）： induction procedures and genetic analysis of regenerants [J]. Plant Sci.， 1995，104（2）：215-224.

[21]謝 冰， 王秀峰， 樊治成. 西葫蘆未受精胚珠離體培養(yǎng)條件的優(yōu)化及胚囊植株的再生[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2006， 39（1）： 132-138.

[22]謝 冰. 西葫蘆的離體雌核發(fā)育及植株再生[D]. 泰安： 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2005.

[23]陳學(xué)軍， 邢國(guó)民， 陳竹君. 西葫蘆未授粉胚珠離體培養(yǎng)和植株再生[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2000， 12（3）： 165-167.

[24]李 佳.百合單倍體培養(yǎng)及細(xì)胞學(xué)觀察[D]. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2011.