張海珊等

摘 要：從采自安徽省肥西縣發(fā)病的水稻材料中提取水稻黑條矮縮病毒dsRNA，利用RT-PCR獲得了病毒基因組片段S10的cDNA克隆，并測(cè)定其全序列。結(jié)果表明：S10全長(zhǎng)1801bp，含有一個(gè)ORF；核苷酸與氨基酸序列同源性比較表明，其與浙江的RBSDV（AY050488）最接近，分別為99.2%和99.6%；與日本的RBSDV（D00606）分別為95.1%和97.5%。

關(guān)鍵詞：水稻黑條矮縮病毒；cDNA克??；S10片段；序列分析

中圖分類(lèi)號(hào) S435.11 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1007-7731（2013）09-31-02

水稻黑條矮縮病毒（rice black-streaked dwarf Fijivirus，RBSDV）是呼腸孤病毒科（Reovirdae）斐濟(jì)病毒屬（Fijivirus）的成員[1]，該病毒基因組是由10條雙鏈RNA組成，按照其在凝膠上的遷移率由慢到快依次命名為S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9和S10[2]。在自然界中，水稻黑條矮縮病毒只能通過(guò)攜帶病毒的灰飛虱（Laodelphax striatellus）以持久性的方式傳播[3]。該病毒主要侵染水稻引起水稻黑條矮縮病，同時(shí)也可侵染小麥、玉米，引起玉米粗縮病和小麥綠矮病等病害[2]，是一種十分重要的作物病毒。20世紀(jì)90年代后期，RBSDV在浙江省暴發(fā)流行，并迅速在長(zhǎng)江流域中東部稻作區(qū)蔓延，成為水稻生產(chǎn)上的毀滅性病害，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。本文報(bào)道了采自安徽省肥西縣的RBSDV水稻分離物基因組片段S10的cDNA克隆及其全序列分析的研究結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料 2010年7月從安徽省肥西縣采集具有典型RBSDV侵染癥狀的水稻樣本，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)已報(bào)道的RBSDV S10基因組序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物P1（擴(kuò)增1-616位點(diǎn)的片段）和P2（擴(kuò)增167-1801位點(diǎn)的片段），由上海生工生物工程有限公司合成。序列如下：P1 F1：5AAGTTTTTTTCCTCACCCATA3，R1：5CCATTTGAGCAGGAACTTCAC3；P2 F2：5TCAAAGCGCCCCACGTTGC3；R2：5GACAATAGCTGAATTTCCCCCTA3。

1.3 總RNA提取及RT-PCR擴(kuò)增 取0.1g凍存水稻病葉，于液氮中充分研磨成粉，然后用Trizol試劑（上海生工生物工程有限公司公司產(chǎn)品）提取病葉總RNA，方法按公司提供的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取8μL RNA模板與1μL R2（下游引物）混勻后，于95℃處理5min后迅速冰浴。然后按以下反應(yīng)體系（25μL）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：5μL 5ⅹ反轉(zhuǎn)錄緩沖液，2.5μL Dntp，1μL Rnase抑制劑和AMV反轉(zhuǎn)錄酶3μL，加0.1%DEPC處理的雙蒸水至25μL，42℃反應(yīng)1h，隨后95℃加熱5min，立即冰浴，合成cDNA第一鏈。PCR擴(kuò)增在50μL反應(yīng)體系中進(jìn)行，反應(yīng)包括2μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，5μL 10ⅹPCR buffer，3μL MgCL2（25mmol/L），1μLdNTP Mixture（10nmol/L），上下游引物各1μL，0.5μL Taq DNA聚合酶（5U/μL），ddH2O36.5μL。充分混勻后，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：94℃變性3min后，94℃30s，58℃45s，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸10min。

1.4 PCR產(chǎn)物克隆及序列測(cè)定 PCR產(chǎn)物純化后，經(jīng)電泳檢測(cè)為目的片段后，直接連接于pMD18-T載體（TaKaRa）上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選重組子，PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定陽(yáng)性重組子。陽(yáng)性克隆委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序、拼接，獲得S10 cDNA全序0。

2 結(jié)果與分析

2.1 安徽RBSDV S10兩段序列的擴(kuò)增 利用P1和P2這兩對(duì)引物，通過(guò)RT-PCR的方法從水稻黑條矮縮病感病葉片總RNA中擴(kuò)增得到600bp和1600bp左右的特異產(chǎn)物（如圖1），片段大小與引物設(shè)計(jì)大小相符。經(jīng)回收后克隆到pMD18-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。陽(yáng)性克隆用于DNA序列測(cè)定，并進(jìn)行拼接。

2.2 安徽RBSDV S10 cDNA全序列分析 通過(guò)片段拼接獲得安徽省水稻黑條矮縮病的病毒分離物基因組第10組分（S10）cDNA克隆。序列分析結(jié)果顯示：S10全長(zhǎng)1801bp，含有一個(gè)ORF開(kāi)放閱讀框，編碼一個(gè)分子量約為63.1kD的蛋白質(zhì)。序列分析表明所測(cè)的病毒分離物S10在總長(zhǎng)度、G/C含量、非編碼區(qū)長(zhǎng)度和開(kāi)放閱讀框（ORF）等基因組織形式與報(bào)道的RBSDV相符合。核苷酸與氨基酸序列同源性比較發(fā)現(xiàn)其與浙江的RBSDV水稻分離物S10基因（AY050488）最接近，分別為99.2%和99.6%；與日本的RBSDV（D00606）分別為95.1%和97.5%；與意大利的MRDV（L76560）相對(duì)較遠(yuǎn)一些，分別為86.8%和91.6%。S10序列分析結(jié)果證明斐濟(jì)病毒屬RBSDV為引起我省水稻黑條矮縮病的病原之一。

3 討論

自2008年以來(lái)，水稻黑條矮縮病在安徽省多個(gè)地區(qū)發(fā)生危害，我們先后對(duì)我省太湖縣、居巢區(qū)、肥西縣、全椒縣等地水稻病毒病發(fā)生狀況進(jìn)行了調(diào)查，并采集了發(fā)病水稻病株。本研究系從我省肥西縣水稻上克隆了RBSDV S10片段序列。序列分析發(fā)現(xiàn)，其與多個(gè)來(lái)自于浙江的RBSDV 的S10序列相似性高達(dá)95.2%～99.2%，推測(cè)安徽省肥西縣的RBSDV病毒與浙江分離的病毒親緣關(guān)系較近。有關(guān)安徽省水稻黑條矮縮病發(fā)生流行的研究報(bào)道較多，但有關(guān)分子方面的研究只有李祥宇等[5]對(duì)安徽省內(nèi)RBSDV的S9部分片段序列進(jìn)行過(guò)研究。通過(guò)對(duì)安徽省RBSDV各個(gè)組分的克隆及序列分析，可以進(jìn)一步認(rèn)識(shí)RBSDV基因組功能結(jié)構(gòu)，有助于深入研究水稻黑條矮縮病毒在安徽省不同作物上的侵染危害、演化、分布、流行規(guī)律，為防治RBSDV提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1 ] Boccardo G，Milne R G. Plant reovirus group [J]. CMI/ AAB Discriptions of Plant Viruses，1984：294.

[2] 張恒木，雷娟利，陳劍平，等.浙江和河北發(fā)生的一種水稻、小麥、玉米矮縮病是水稻黑條矮縮病毒引起的[J].中國(guó)病毒學(xué)，2001，16（3）：246-251.

[3] Shikata E，Kitagawa Y. Rice black-streaked dwarf virus： Its properties，morphology and intracellular localization. Virology，1977，77（2）：826-842.

[4] Wang H D，Chen J P，Wang A G，et al Studies on the epidemiology and yield losses from rice black streaked dwarf disease in a recent epidemic in Zhejiang province，China[J]. Plant Pathology，2009，58（5）：815-825.

[5]李祥宇，閆德龍，鄭兆陽(yáng)，等.安徽省水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒的分子檢測(cè)和序列分析[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，40（1）：146-151. （責(zé)編：陶學(xué)軍）