余可和 余洋　周一飛　毛誠晃　周望者

[摘要] 目的 通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于體外條件下觀察補(bǔ)腎中藥對(duì)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖分化的影響。 方法 將不同濃度的補(bǔ)腎中藥方劑與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外共同培養(yǎng)，測(cè)定細(xì)胞增殖功能，檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖與分化指標(biāo)（包括堿性磷酸酶、礦化結(jié)節(jié)）。 結(jié)果 與空白組比較，濃度100 mg/L、200 mg/L的補(bǔ)腎中藥在不同時(shí)間段均可提高骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖率（P < 0.05）；與空白組比較，濃度20 mg/L、40 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的補(bǔ)腎中藥可使ALP活性增強(qiáng)、礦化結(jié)節(jié)數(shù)量增多（P < 0.05）。 結(jié)論 較高濃度的補(bǔ)腎中藥能促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨潛能。

[關(guān)鍵詞] 補(bǔ)腎中藥；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；堿性磷酸酶；礦化結(jié)節(jié)

[中圖分類號(hào)] R274 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）08-0001-03

骨質(zhì)疏松癥是中老年人最常見的慢性病之一，其特征主要表現(xiàn)為骨的微觀結(jié)構(gòu)退化、骨量減少。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的重要原因是腎氣虛衰，補(bǔ)腎中藥方劑是治療骨質(zhì)疏松癥較為有效的藥方。目前在補(bǔ)腎中藥促進(jìn)成骨的基礎(chǔ)研究方面取得了一些成果[1]，但是目前有關(guān)補(bǔ)腎中藥復(fù)方的研究仍在探索階段。本實(shí)驗(yàn)自擬對(duì)成骨有作用的補(bǔ)腎中藥進(jìn)行組合， 對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，從細(xì)胞水平檢測(cè)補(bǔ)腎復(fù)方對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的影響，觀察成骨情況。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

選用出生6周齡雄性SD大鼠，體重不限，購于溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證書：SCXK（浙）2006-0026。

1.2 中藥藥材

藥材（淫羊霍、杜仲、骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂、黨參、熟地、川牛膝、云苓、白術(shù)、煅龍骨、炒山藥、生蠣、丹皮）購自浙江溫州地區(qū)醫(yī)藥公司。

1.3 儀器與試劑

Thermo二氧化碳培養(yǎng)箱；Nikon 倒置生物顯微鏡；掃描電鏡，上海泰思肯貿(mào)易有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、MTT試劑、地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉、四環(huán)素鹽酸鹽， 均為Sigma 公司產(chǎn)品；胎牛血清，上海勁馬生物科技有限公司；堿性磷酸酶試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.4 方法

1.4.1 補(bǔ)腎中藥水提取液的制備 取淫羊霍、杜仲、骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂、黨參、熟地、川牛膝、云苓、白術(shù)、煅龍骨、炒山藥、生蠣、丹皮，按比例稱重混合后，加蒸餾水浸泡并煮沸3次，每次3 h，合并濾液并濃縮，用75%乙醇沉淀后靜置于冰箱過夜，次日過濾回收乙醇，用0.5%NaOH調(diào)pH至7.0，制成含生藥1 g/mL的藥液，冷藏備用。

1.4.2 大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)鑒定[2] 取出生6周左右的雄性SD大鼠，體重不限（由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。頸椎脫位法處死，無菌條件下取股骨，剪斷兩骨端，無血清培養(yǎng)液吹打髓腔并沖出骨髓。將組織均勻平鋪加10%DMEM培養(yǎng)基接種于10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3 d換液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底時(shí)后傳代，利用第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并用鈣鈷法進(jìn)行堿性磷酸酶染色。

1.4.3 細(xì)胞增殖功能測(cè)定 采用MTT法[3]測(cè)定補(bǔ)腎中藥方劑對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響。細(xì)胞消化傳代后，調(diào)整細(xì)胞濃度加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入培養(yǎng)液，放入5% CO2 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)合適后，分別換入含1 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、100 mg/L、200 mg/L補(bǔ)腎中藥的DMEM培養(yǎng)基，共6組，每組12孔；對(duì)照為空白組，為單用20ng/mL的地塞米松。含不同濃度補(bǔ)腎方劑培養(yǎng)1、3、7、10 d。采用MTT法于490 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)試各孔光吸收值。本檢測(cè)方法重復(fù)3次，分別計(jì)算對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的增殖率。

1.4.4 細(xì)胞功能的表達(dá) 大鼠骨髓基質(zhì)干以每孔1×105個(gè)/孔的密度被接種于6孔培養(yǎng)板，加入培養(yǎng)液，3 d后分別換入含0 mg/L、1 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、100 mg/L、200 mg/L補(bǔ)腎中藥的DMEM培養(yǎng)基，定期更換培養(yǎng)液及干預(yù)藥物，不進(jìn)行傳代直至檢測(cè)。

①細(xì)胞分化功能測(cè)定（ALP活性測(cè)定） 分別取各組（藥液濃度分別為0 mg/L、1 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、100 mg/L、200 mg/L，共7組）培養(yǎng)至第7天的成骨細(xì)胞，倒除原培養(yǎng)液，經(jīng)胰蛋白酶消化后吸出消化液，加入0.9%NaCl吹打后低溫凍溶至破碎，離心后上清液行酶免法測(cè)定堿性磷酸酶含量。②細(xì)胞礦化功能測(cè)定 同上述方法培養(yǎng)至第14天，利用von Kossa染色法顯示礦化結(jié)節(jié)。培養(yǎng)14 d后采用多聚甲醛進(jìn)行固定。以直徑>200 μm邊界清晰的結(jié)節(jié)，為礦化結(jié)節(jié)的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)[1]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件處理，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，多組間采用方差分析，然后行兩兩t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞的鑒定

倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，培養(yǎng)1 d后大部分的細(xì)胞為圓形，大小不等漂浮于培養(yǎng)液；培養(yǎng)2 d后部分細(xì)胞貼壁，形態(tài)主要為梭形、多角形或紡錘形等幾種形狀（圖1）。培養(yǎng)后7 d貼壁細(xì)胞增多可見偽足，瓶底長(zhǎng)滿梭形或多角形細(xì)胞（圖2）；10 d可見貼壁細(xì)胞形多呈梭形（圖3）。von Kossa染色礦化結(jié)節(jié)（圖4）。

2.2 補(bǔ)腎中藥方劑對(duì)大鼠MSCs增殖的影響

如表1所示，在1 d時(shí)100 mg/組高于空白組（t = 6.21，P < 0.001），且200 mg/組也高于空白組（t = 10.27，P < 0.001），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；在3 d時(shí)濃度為20 mg/L（t = 6.89，P < 0.001）、40 mg/L（t = 6.63，P < 0.001）、100 mg/L（t = 14.49，P < 0.001）、200 mg/L（t = 22.21，P < 0.001）的OD值均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；在7 d時(shí)濃度為20 mg/L（t = 15.39，P < 0.001）、40 mg/L（t = 24.36，P < 0.001）、100 mg/L（t = 32.84，P < 0.001）、200 mg/L（t = 29.80，P < 0.001） 的OD值均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）；在10 d時(shí)濃度為20 mg/L（t = 38.80，P < 0.001）、40 mg/L（t = 45.13，P < 0.001）、100 mg/L（t = 37.79，P < 0.001）、200 mg/L（t = 49.71，P < 0.001）的OD值均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。隨著濃度的增高，補(bǔ)腎中藥方劑對(duì)大鼠MSCs增殖的影響有促進(jìn)作用。

2.3 對(duì)礦化結(jié)節(jié)數(shù)的影響

如表2所示，選取第14天，濃度20 mg/L組、40 mg/L組、100 mg/組、200 mg/組的礦化結(jié)節(jié)數(shù)與空白組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。說明隨著補(bǔ)腎中藥濃度的提高，其促進(jìn)成骨作用逐步增強(qiáng)。

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是存在于骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞，它具有多向分化潛能，能夠自我更新，可在體外培養(yǎng)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在一定的誘導(dǎo)條件下可以向軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等多個(gè)方向分化[4]。成骨細(xì)胞是體內(nèi)骨形成的主要細(xì)胞也是骨代謝的重要功能細(xì)胞，對(duì)維持骨的代謝平衡非常重要[5]。成骨細(xì)胞功能障礙或數(shù)量減少，都會(huì)導(dǎo)致骨組織代謝異常、骨質(zhì)疏松等多種疾病的發(fā)生。骨質(zhì)疏松癥在中醫(yī)學(xué)上被認(rèn)為是腎氣虛衰所致，因此近年來越來越多的研究利用補(bǔ)腎中藥來治療骨質(zhì)疏松癥。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度組的補(bǔ)腎中藥均可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖， 增強(qiáng)堿性磷酸酶的活性。堿性磷酸酶是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的主要特征性酶，也是最早出現(xiàn)的指標(biāo)，其由成骨細(xì)胞產(chǎn)生并可反映分化程度的高低。目前比較普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為，堿性磷酸酶在體外的鈣化中起著關(guān)鍵的作用[6]，堿性磷酸酶活性的高表達(dá)標(biāo)志著成骨細(xì)胞的分化成熟[7]。相較于堿性磷酸酶，礦化結(jié)節(jié)為骨形成的標(biāo)志，它的形成代表了細(xì)胞進(jìn)一步成骨分化成熟[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的補(bǔ)腎中藥在不同程度上能刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖分化成骨。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為“腎主藏精”，腎精可以生骨養(yǎng)髓的。本方劑所涵蓋的多味補(bǔ)腎中藥中部分作為單味中藥在體外有促進(jìn)向骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用。殷曉雪等[9]的研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿可以上調(diào)BMP-2基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化。徐展望等[10]的研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂能促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的增殖。張立等[11]的研究發(fā)現(xiàn)杜仲也能通過刺激成骨細(xì)胞的增殖分化促進(jìn)骨的重建。此外，Wang等[12]的研究指出骨碎補(bǔ)能促進(jìn)人成骨細(xì)胞增殖作用。本實(shí)驗(yàn)中的補(bǔ)腎中藥是在上述單味補(bǔ)腎藥物的基礎(chǔ)上經(jīng)過組合構(gòu)成，它能夠促進(jìn)大鼠體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及其向成骨細(xì)胞分化。

通過本實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎中藥對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增值的影響。在低濃度不但沒有毒害作用，而且隨著濃度的增加，細(xì)胞增值作用遞增。中藥具有誘導(dǎo)分化的作用，和空白組相比（空白組也加入了誘導(dǎo)成骨液），中藥有誘導(dǎo)基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的作用。中期的ALP和細(xì)胞分化成熟晚期的礦化結(jié)節(jié)表明，藥物對(duì)細(xì)胞的分化成熟作用明顯，特別是對(duì)成骨晚期的骨礦化，補(bǔ)腎中藥顯示出極佳的促成骨作用。

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（收稿日期：2013-01-10）