杜嫚　王紅瑩

摘 要：zfol是斑馬魚的一種母源凝集素基因。從斑馬魚胚胎中提取RNA，應(yīng)用RT-PCR從斑馬魚中得到zfol的基因片段，重組入原核表達(dá)載體pEASY-E2中得到重組質(zhì)粒，并測序鑒定其序列的正確性，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)，并純化蛋白，利用純化的重組蛋白為抗原免疫兔子，制備斑馬魚母源凝集素Zfol蛋白的多克隆抗體，利用Western-blot方法檢測抗體特異性，得到特異的多克隆抗體，為進(jìn)一步研究母源凝集素基因zfol的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：斑馬魚；zfol；原核表達(dá)；多克隆抗體

中圖分類號 S965.299 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 B 文章編號 1007-7731（2013）06-14-03

免疫系統(tǒng)是機(jī)體執(zhí)行免疫應(yīng)答及免疫功能的一個重要系統(tǒng)，保衛(wèi)機(jī)體免受疾病的危害，免疫系統(tǒng)以基本的免疫系統(tǒng)（以酶的形式存在于細(xì)菌中免受噬菌體感染）或者復(fù)雜的免疫系統(tǒng)（人體內(nèi)）存在于所有生物體中。另外一些基本的免疫機(jī)制是從古老的真核生物演變而來，存在于后代生物中，例如植物和昆蟲，包括吞噬作用，抗菌類多肽如防衛(wèi)素，以及補(bǔ)體系統(tǒng)[1-2]。大多數(shù)魚類在尚未發(fā)育完全時，其對外界病原微生物仍然具有一定的抵御能力，這種抵御能力主要來自于自身非特異性免疫和母源性免疫。而存在于卵母細(xì)胞中的凝集素、溶菌酶等物質(zhì)被認(rèn)為是來自于母體的免疫物質(zhì)，并且在魚類胚胎發(fā)育中可能發(fā)揮重要作用[3]。目前對魚類胚胎發(fā)育早期的先天免疫機(jī)制的研究已經(jīng)成為魚類免疫學(xué)研究的重點(diǎn)領(lǐng)域，主要是由于魚類在胚胎發(fā)育早期的致死率較高[4-5]。

斑馬魚作為新型模式生物，具有以下優(yōu)點(diǎn)：成年魚個體小，易于飼養(yǎng)；胚胎體外發(fā)育，易于觀察和操作；品系資源豐富；發(fā)育快速、性成熟期短、繁殖力強(qiáng)，以利于提供充足的實(shí)驗(yàn)材料；較完善的胚胎和遺傳學(xué)操作技術(shù)，如轉(zhuǎn)基因、基因過表達(dá)等技術(shù)。近年來隨著對斑馬魚研究的不斷深入，其應(yīng)用范圍已經(jīng)涵蓋魚類免疫系統(tǒng)發(fā)生、病原和宿主研究的各個方面[6-7]。筆者試圖通過構(gòu)建母源凝集素zfol基因原核表達(dá)載體，制備多克隆抗體，并用此抗體檢測斑馬魚中該基因的表達(dá)，為進(jìn)一步研究該基因的功能提供條件，也為深入研究母源凝集素基因在魚類胚胎發(fā)育早期的免疫保護(hù)作用中扮演的角色奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 斑馬魚（Danio rerio），選取生命力旺盛，具有活躍繁殖力的適齡斑馬魚，由中國海洋大學(xué)分子醫(yī)學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 酶及相關(guān)試劑 限制性內(nèi)切酶購自NEB；T4連接酶購自Promega；膠回收、質(zhì)粒提取等相關(guān)試劑盒購自TaKaRa；RNA提取試劑盒購自Fastagen公司；His Bind Purification kit購自Novagen公司；弗氏佐劑購自Sigma公司；DMEM購自Gibco公司。

1.3 菌株及質(zhì)粒 大腸桿菌BL-21由本實(shí)驗(yàn)室保存；原核表達(dá)載體pEASY-E2由中國海洋大學(xué)分子醫(yī)學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 方法

1.4.1 引物設(shè)計(jì) 5引物（5-GGGAATTCCATATGGACTGTACTATAATGAATGG-3），3引物（5-CCGCTCGAGCCGACTCACACCAACTCTTT-3），5引物中含有NdeI酶切位點(diǎn)CATATG，3引物中含有XhoI酶切位點(diǎn)CTGGAG，用于擴(kuò)增得到zfol的目的基因片段。

1.4.2 總RNA的提取和目的片段的擴(kuò)增 取斑馬魚早期胚胎數(shù)十枚，用RNA提取試劑盒提取總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：（1）體系一：oligo dT 1μL，mRNA 2μg，加Rnase free ddw至13μL，70℃孵育5min；（2）體系二：逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，buffer 5μL，dNTP 5μL，RNA酶抑制劑1μL；（3）體系一孵育完成后，將體系二加入其中，震蕩混勻，42℃孵育60min，然后70℃孵育15min。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s，進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸10min。

1.4.3 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 zfol基因PCR擴(kuò)增結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物純化，用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI雙酶切，提取原核表達(dá)載體pEASY-E2質(zhì)粒，同樣用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI雙酶切，酶切完成后，回收酶切產(chǎn)物，將zfol基因片段與表達(dá)載體pEASY-E2用T4連接酶連接起來，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，測序鑒定出序列正確的克隆。

1.4.4 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)和純化 選取測序無誤的克隆，提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑單克隆并培養(yǎng)至OD600≈0.5，加入終濃度為1mmol的IPTG，37℃條件下誘導(dǎo)4h后離心并收集菌體，4℃、12 000g離心1min，離心棄上清，將菌體沉淀重懸于100μL 2×上樣緩沖液（100mmol/L Tris，pH6.8，200mmol/LDTT，0.2%溴酚藍(lán)，20%甘油，4%SDS）。菌懸液沸水浴煮5min，立即冰浴2min，4℃離心5min，取20μL樣品上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。用親和素-生物素親和層析純化原核表達(dá)載體表達(dá)的蛋白。

1.4.5 多克隆抗體的制備及特異性檢測 純化后的zfol蛋白與弗氏佐劑等體積混合乳化，對免疫動物日本大耳白兔的背部皮下多點(diǎn)注射。第1次注射2～3周后再加強(qiáng)免疫3次，各次劑量為第1次注射的1/4，每次間隔10d，后3次以弗式不完全佐劑乳化樣品。在第4次注射后10d經(jīng)心臟取血，按常規(guī)方法分離血清。取未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒的菌體總蛋白進(jìn)行Western-blot檢測抗體的特異性，SDS-PAGE電泳分離。電泳結(jié)束之后，切下含有目的蛋白的PAGE膠，通過電轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)好的膜經(jīng)TBS洗滌后，在5%的脫脂奶粉中封閉至少2h；將封閉好的膜用TBST洗滌后，加一抗孵育，zfol多克隆抗體為一抗（1：200稀釋），4℃搖床孵育過夜；TBST洗膜5min×4次，加二抗（羊抗兔1：1 000）孵育至少2h；TBST洗膜5min×4次，然后用ECL顯色液顯色，用凝膠掃描分析系統(tǒng)掃描存圖，并用分析軟件GENETOOL分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取和zfol的擴(kuò)增 取斑馬魚早期胚胎30枚左右，用RNA提取試劑盒提取總RNA，用于反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，從圖1（A）中可看出28S、18S和5.8S 3條RNA帶型，提取的RNA能夠用于反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以cDNA為模板，用設(shè)計(jì)好的引物擴(kuò)增zfol基因片段，zfol基因cDNA全長為771bp，所擴(kuò)增zfol的基因片段長度為579bp，從圖1（B）可以看出，擴(kuò)增大小在預(yù)期片段大小范圍內(nèi)。

2.2 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將zfol基因擴(kuò)增后的片段經(jīng)處理后，連接到表達(dá)載體中，用融合蛋白的形式表達(dá)。通過測序驗(yàn)證所構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒是否正確，圖2中的測序結(jié)果與zfol基因序列比對，結(jié)果一致。

2.3 zfol多克隆抗體的制備和特異性分析 用Western免疫印跡檢測抗血清的特異性。結(jié)果顯示，以未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒的菌體蛋白作對照，沒有信號，而經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒的菌體蛋白能夠檢測到信號，抗體能特異地識別28kD的zfol蛋白（圖3）。

3 結(jié)論與討論

凝集素在低等脊椎動物和無脊椎動物中是種重要的免疫介質(zhì)，并且它們能夠結(jié)合碳水化合物，這些碳水化合物涉及到對細(xì)胞壁的附著，因此，凝集素能阻止這種附著作用及隨后的入侵。對凝集素在早期胚胎發(fā)育中免疫保護(hù)作用的深入研究，有利于降低魚類在早期胚胎發(fā)育時期的死亡率。zfol作為斑馬魚的一種母源凝集素基因，有可能在早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮免疫保護(hù)作用。在本研究中，筆者原核表達(dá)了從斑馬魚中鑒定出來的一種母源凝集素基因zfol，并成功制備了多克隆抗體。該多克隆抗體的制得為進(jìn)一步研究zfol在斑馬魚胚胎發(fā)育早期中發(fā)揮的重要作用奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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[3]王志平. 斑馬魚（Danio rerio）母源性補(bǔ)體因子的傳遞和免疫功能以及補(bǔ)體系統(tǒng)的個體發(fā)育[D]. 青島：中國海洋大學(xué)，2008.

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[7]孫智慧，賈順姬，孟安明. 斑馬魚：在生命科學(xué)中暢游[J]. 生命科學(xué)，2006，18：431-436.

（責(zé)編：徐世紅）