姚金光　解繼勝　李俊等

[摘要] 目的 以舌癌Tca8113M1細(xì)胞系單細(xì)胞培養(yǎng)建系為基礎(chǔ)，觀察Tca8113M1細(xì)胞系中舌癌干細(xì)胞存在的現(xiàn)象及其相關(guān)標(biāo)志的變化規(guī)律。方法 選取Tca8113M1細(xì)胞系，以有限稀釋法進(jìn)行體外單細(xì)胞培養(yǎng)并建立細(xì)胞亞系，在證實(shí)其成瘤性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志CD44、CD184、細(xì)胞外可溶性抗原（ESA）的表

達(dá)情況，著重觀察單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)形成細(xì)胞克隆的形態(tài)與時(shí)間。結(jié)果 以有限稀釋法獲取192個(gè)Tca8113M1舌癌單個(gè)細(xì)胞，在96孔板中進(jìn)行體外培養(yǎng)，獲取12個(gè)細(xì)胞亞系（獲取比例為6.25%），均有高成瘤性。癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志CD44

與ESA均為高水平表達(dá)，而CD184表達(dá)則在12個(gè)細(xì)胞系之間有差異。在單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)中，形成完全克隆、部分克隆與旁克隆3種形態(tài)，12個(gè)細(xì)胞亞系均源于單個(gè)細(xì)胞形成的完全克隆，均可進(jìn)行連續(xù)傳代與擴(kuò)增，而部分克隆與旁克隆則在后續(xù)培養(yǎng)中逐漸衰老與消亡。結(jié)論 Tca8113M1細(xì)胞系中可能存在癌干細(xì)胞，而單細(xì)胞培養(yǎng)可形成完全克隆并建立細(xì)胞亞系，是進(jìn)行舌癌干細(xì)胞后續(xù)研究重要的細(xì)胞培養(yǎng)模式。

[關(guān)鍵詞] 單細(xì)胞； 有限稀釋法； 舌癌干細(xì)胞； 完全克隆

[中圖分類號(hào)] Q 21 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.021 癌干細(xì)胞是癌組織中一小群具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，具有自我復(fù)制與更新的能力，而且增殖與分裂能力極強(qiáng)，少量細(xì)胞即可形成體外移植瘤[1]。近年

有關(guān)腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥與復(fù)發(fā)等諸多難題均從癌干細(xì)胞的角度進(jìn)行研究。這種研究的基礎(chǔ)和前提是明確癌干細(xì)胞的標(biāo)志或分離出癌干細(xì)胞，以提供研究的靶細(xì)胞。目前已發(fā)現(xiàn)多種永生性癌細(xì)胞系中存在有癌干細(xì)胞，Tca8113M1舌癌細(xì)胞系同樣可能存在有癌干細(xì)胞，可以作為舌癌干細(xì)胞的研究對(duì)象。鑒于癌干細(xì)胞獨(dú)特的自我復(fù)制與更新能力，本研究以Tca8113M1舌癌細(xì)胞系為研究對(duì)象，采用有限稀釋法分離出單個(gè)舌癌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，利用癌干細(xì)胞的自我復(fù)制能力進(jìn)行分裂增殖，形成預(yù)期的單細(xì)胞克隆，進(jìn)一步形成細(xì)胞亞系，以此證明Tca8113M1

舌癌細(xì)胞系中存在癌干細(xì)胞的可能性，同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞亞系癌干細(xì)胞標(biāo)志的表達(dá)情況，觀察不同細(xì)胞亞系的生物學(xué)特性，并且動(dòng)態(tài)觀察單細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞克隆形成的規(guī)律，為從Tca8113M1細(xì)胞系中分離舌癌干細(xì)胞提供前期實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 舌癌細(xì)胞系來(lái)源

人舌癌細(xì)胞系Tca8113由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科腫瘤生物實(shí)驗(yàn)室建系，四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院贈(zèng)送。右江民族醫(yī)學(xué)院腫瘤分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室在此基礎(chǔ)上建立了轉(zhuǎn)移人舌癌細(xì)胞系Tca8113M1[2]。

1.2 主要試劑和儀器

胎牛血清（Hyclone公司，美國(guó)），RPMI1640培

養(yǎng)基（Gibco公司，美國(guó)）；PE標(biāo)記抗人CD44抗體，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的抗人細(xì)胞外可溶性抗原（extracellular soluble anti-

gen，ESA）抗體，PE/cy5標(biāo)記抗人CD184抗體，同

型對(duì)照抗體分別為大鼠IgG2bκ2、小鼠IgG1與小鼠IgG2aκ4。CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司），流式細(xì)胞儀（BD公司，美國(guó)），倒置顯微鏡（Olympus公司，日

本）。

1.3 體外單細(xì)胞培養(yǎng)、建系及細(xì)胞克隆生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)

觀察

采用有限稀釋法進(jìn)行體外單細(xì)胞培養(yǎng)與建系。Tca8113M1細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至96孔板，采用有限稀釋法保證每個(gè)孔有1個(gè)細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)和增殖情況，待其生長(zhǎng)成多個(gè)細(xì)胞克隆后，用0.25%胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)移至6孔板擴(kuò)增培養(yǎng)后，在培養(yǎng)瓶中反復(fù)傳代建立細(xì)胞亞系。此外，在此培養(yǎng)過(guò)程中動(dòng)態(tài)觀察單個(gè)細(xì)胞形成細(xì)胞克隆的形態(tài)與生長(zhǎng)情況，觀察時(shí)點(diǎn)分別為3 d和1、2、3周。

1.4 舌癌細(xì)胞亞系成瘤性檢測(cè)

建立裸鼠皮下移植瘤模型。體外培養(yǎng)Tca8113、Tca8113M1、Tca8113M1舌癌細(xì)胞亞系細(xì)胞，選取形態(tài)良好的生長(zhǎng)期細(xì)胞，在生長(zhǎng)旺盛時(shí)接種。具體步驟如下：消化收集舌癌細(xì)胞，800 r·min-1離心3～

5 min，棄上清液，計(jì)數(shù)細(xì)胞總量，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液按每毫升1×107個(gè)細(xì)胞的密度稀釋細(xì)胞；消毒裸鼠右腋窩的皮膚，將細(xì)胞接種于皮下，以皮下結(jié)節(jié)直徑超過(guò)1.0 cm為成瘤標(biāo)準(zhǔn)。共接種裸鼠45只，具體分組如下：1）Tca8113M1舌癌細(xì)胞亞系組，共12個(gè)亞系，每組3只，共36只；2）Tca8113M1舌癌細(xì)胞組，6只，為母系細(xì)胞系對(duì)照組；3）Tca8113舌癌細(xì)胞組，3只，為來(lái)源細(xì)胞系對(duì)照組。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)舌癌細(xì)胞亞系癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)

志CD44、CD184、ESA的表達(dá)情況

將舌癌細(xì)胞（密度為每毫升1×106個(gè)）消化以后，800 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入D-hanks液重懸，盡量將細(xì)胞吹散，將細(xì)胞懸液分別移入試管中（每管體積為500 μL），設(shè)置對(duì)照管和樣本管。在對(duì)照管中加入同型對(duì)照抗體（分別是大鼠IgG2bκ2、小鼠

IgG1與小鼠IgG2aκ4）各5 μL，在樣本管中加入熒光抗體（PE標(biāo)記抗人CD44、FITC標(biāo)記抗人ESA、PE/cy5

標(biāo)記抗人CD184）各5 μL，置于避光環(huán)境下室溫孵育30 min，然后于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)CD44、CD184、ESA的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 Tca8113M1細(xì)胞體外單細(xì)胞建系培養(yǎng)

Tca8113M1單細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，細(xì)胞貼壁；24 h后部分細(xì)胞出現(xiàn)變大變薄、空泡樣變等老化現(xiàn)象；3 d后，有7個(gè)孔的細(xì)胞出現(xiàn)增殖分裂現(xiàn)象；7～10 d后有12個(gè)孔的細(xì)胞開(kāi)始增殖為單個(gè)或數(shù)個(gè)完全細(xì)胞克?。寺⌒纬蛇^(guò)程見(jiàn)圖l）。

培養(yǎng)4～6周后，細(xì)胞基本達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)并增殖的狀態(tài)，以癌細(xì)胞的克隆樣生長(zhǎng)為主，細(xì)胞呈鋪路石狀，可見(jiàn)巨核、多核細(xì)胞，核分裂象多見(jiàn)。待培養(yǎng)孔接近80%鋪滿時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板上擴(kuò)增培養(yǎng)，1～2周后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)傳代培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代30代后凍存。本研究以有限稀釋法獲取192個(gè)Tca8113M1舌癌單細(xì)胞，并在96孔板中進(jìn)行體外傳代建系培養(yǎng)，獲取12個(gè)細(xì)胞亞系，比例為6.25%，分別命名為T(mén)ca8113-S1～Tca8113-S12。

2.2 Tca8113M1細(xì)胞體外單細(xì)胞培養(yǎng)形成細(xì)胞克隆

的動(dòng)態(tài)觀察

以3 d和1、2、3周為觀察時(shí)點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞形成細(xì)胞克隆的形態(tài)主要有3種：完全克隆、部分克隆、旁克隆。Tca8113-S1～Tca8113-S12細(xì)胞亞系的細(xì)胞均源于單個(gè)細(xì)胞形成的完全克隆，均可以進(jìn)行連續(xù)傳代與細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增，而其他單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)形成的部分克隆與旁克隆則在后續(xù)培養(yǎng)中逐漸衰老與消亡，未能連續(xù)傳代進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增。3種克隆在培養(yǎng)過(guò)程中的變化情況如下。1）完全克?。杭?xì)胞之間緊湊密集成型，增殖速度快，其中1～2周為典型的完全克隆狀，3周時(shí)在細(xì)胞克隆中央出現(xiàn)細(xì)胞重疊生長(zhǎng)現(xiàn)象（圖2中A1～A4）；2）部分克?。嚎寺⌒螒B(tài)界于旁克隆與完全克隆之間，細(xì)胞間較疏松，其中1～2周為典型的部分克隆狀，但第3周細(xì)胞克隆疏松，形狀消散，

有轉(zhuǎn)變?yōu)榕钥寺〉内厔?shì)（圖2中B1～B4）；3）旁克?。?/p>

細(xì)胞間疏松不成型，第1周較典型，第2、3周后細(xì)胞老化（圖2中C1～C4）。

2.3 Tca8113M1舌癌細(xì)胞亞系成瘤情況

將舌癌細(xì)胞亞系Tca8113-S1～Tca8113-S12接種于裸鼠皮下后，1周后可觸及皮下結(jié)節(jié)，表面光滑、質(zhì)硬、可活動(dòng)；2周后可見(jiàn)皮下結(jié)節(jié)生長(zhǎng)迅速；3～4周后皮下結(jié)節(jié)最大直徑達(dá)1.0 cm以上。含對(duì)照組在內(nèi)的45只裸鼠均接種成瘤，成瘤率為100%。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞亞系癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志

CD44、CD184、ESA表達(dá)情況

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1：除了Tca8113-S1、Tca8113-S6與Tca8113-S10的ESA陽(yáng)性表達(dá)率分別為60.7%±3.6%、74.1%±1.5%與65.3%±2.8%外，其余細(xì)胞亞系ESA的陽(yáng)性表達(dá)率均在80%以上；各亞系CD44陽(yáng)性表達(dá)率均很高，除了Tca8113-S7為68.9%±2.4%外，其余亞系的陽(yáng)性率均在90%以上；12個(gè)亞系的CD184表達(dá)存在差異，陽(yáng)性率在14.8%±3.5%至74.4%±1.5%之間波動(dòng)。

3 討論

本研究利用有限稀釋法等經(jīng)典的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，以舌癌Tca8113M1細(xì)胞系為研究對(duì)象，隨機(jī)選取192個(gè)舌癌細(xì)胞，在96孔板中進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，共建立12個(gè)舌癌Tca8113細(xì)胞亞系，比例為6.25%，而且都具備很強(qiáng)的成瘤性。進(jìn)一步檢測(cè)12個(gè)Tca8113細(xì)胞亞系的癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CD44與ESA均為高水平表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率多在90%左右，而CD184的陽(yáng)性表達(dá)率則各有不同。據(jù)此結(jié)果可以結(jié)合癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性對(duì)本實(shí)驗(yàn)獲得的細(xì)胞系進(jìn)行分析。

本研究發(fā)現(xiàn)：舌癌Tca8113M1細(xì)胞系中有6.25%的單個(gè)細(xì)胞可以進(jìn)行自我分裂、增殖，形成細(xì)胞亞系。還有研究[3]發(fā)現(xiàn)：Tca8113細(xì)胞連續(xù)經(jīng)過(guò)兩次單細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，其中具備分裂增殖活性的細(xì)胞比例為5.09%～10.85%。這提示即使在永生化細(xì)胞系中，具備持續(xù)增殖能力的細(xì)胞占整個(gè)群體的比例都較少。根據(jù)目前的文獻(xiàn)[4]報(bào)道，在癌細(xì)胞群或組織中，癌干

細(xì)胞比例為0.01%～5%；體外培養(yǎng)的永生化癌干細(xì)胞系中，癌干細(xì)胞的比例可能偏高一些。本研究采用經(jīng)典的有限稀釋法獲取單個(gè)細(xì)胞，這種細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)大的增殖與分裂活力，而且還形成了成瘤性很強(qiáng)的細(xì)胞亞系。這些單個(gè)培養(yǎng)的細(xì)胞是否就是癌干細(xì)胞尚需進(jìn)行單細(xì)胞水平的鑒定，但可以大膽推測(cè)的是，其中應(yīng)該包含有癌干細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞的概念于20世紀(jì)60年代提出，并據(jù)此建立了腫瘤細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)。本研究在單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)，單細(xì)胞的增殖方式是克隆樣增殖，即形成一個(gè)細(xì)胞克隆后擴(kuò)大生長(zhǎng)，并且在周圍形成小的細(xì)胞克隆，最后融合成片，但究其細(xì)胞來(lái)源就是一個(gè)癌細(xì)胞而已，所有后續(xù)的細(xì)胞克隆與癌細(xì)胞就是源于它，所以可以認(rèn)為該細(xì)胞具有癌干細(xì)胞的潛質(zhì)，可以考慮從癌細(xì)胞系中篩選癌干細(xì)胞。

在12個(gè)Tca8113細(xì)胞亞系中，為明確其癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志的表達(dá)情況，為后續(xù)舌癌干細(xì)胞的篩選提供前期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，本研究綜合文獻(xiàn)報(bào)道，選取了CD44、ESA與CD184等癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志進(jìn)行檢測(cè)。CD44是乳腺癌、頭頸部腫瘤、結(jié)腸癌等上皮組織的癌干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志，CD184是胰腺癌干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志；ESA則是上皮來(lái)源的癌干細(xì)胞標(biāo)志，而且屬于細(xì)胞黏附分子[5-6]。在本研究建立的12個(gè)細(xì)胞亞系中，

CD44與ESA均處于高水平表達(dá)，而CD184的表達(dá)則高低不一，其中亞系間均數(shù)差值最大者接近60%。從這3個(gè)指標(biāo)的表達(dá)情況來(lái)分析，可以進(jìn)行如下推測(cè)：1）CD44與ESA是不同細(xì)胞亞系共有的標(biāo)志，提示這些細(xì)胞亞系可能具有共同的組織起源；2）CD184的差異性表達(dá)提示Tca8113細(xì)胞系中存在細(xì)胞異質(zhì)性，但從其比例來(lái)看，大致有3個(gè)等級(jí)，即15%、30%、50%以上，提示其生物學(xué)特性可能有明顯的差別，但可作為舌癌干細(xì)胞研究的候選細(xì)胞群體進(jìn)行研究。

此外，在單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)上建立細(xì)胞亞系的過(guò)程中，筆者發(fā)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞形成細(xì)胞克隆的形態(tài)與細(xì)胞最后成系關(guān)系密切。在單個(gè)細(xì)胞形成完全克隆、部分克隆以及旁克隆等3種克隆形式中，只有完全克隆能夠形成細(xì)胞亞系，而且這些細(xì)胞亞系表現(xiàn)出腫瘤的異質(zhì)性與成瘤性，而部分克隆以及旁克隆則在傳代與擴(kuò)增培養(yǎng)過(guò)程中逐漸老化或消亡。這一結(jié)果可進(jìn)行逆向推理：將最初形成完全克隆的12個(gè)細(xì)胞確定為舌癌干細(xì)胞，而其形成的完全克隆則是癌干細(xì)胞自我更新與增殖的結(jié)果，其中可能富含癌干細(xì)胞。這一觀點(diǎn)也為前列腺癌、小鼠肉瘤、胰腺癌以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等相關(guān)研究[7-12]所證實(shí)。這些研究發(fā)現(xiàn)完全克隆細(xì)胞可以高表達(dá)癌干細(xì)胞標(biāo)志；接種1 000個(gè)完全克隆前列腺癌細(xì)胞就可形成移植瘤；通過(guò)懸浮球培養(yǎng)的癌細(xì)胞球在消化后進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，可以形成高比例的完全克隆。有學(xué)者[13]進(jìn)一步在頭頸腫瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，CD133與CD44陽(yáng)性表達(dá)的癌細(xì)胞多形成完全克隆，而CD133與CD44陰性的癌細(xì)胞則多趨向于形成部分克隆或旁克隆，從而認(rèn)為CD133與CD44是頭頸腫瘤癌干細(xì)胞的標(biāo)志。由此可見(jiàn)，完全克隆為癌干細(xì)胞的自我更新方式與富集、純化癌

干細(xì)胞及癌干細(xì)胞標(biāo)志的研究提供了新的途徑，近年在癌干細(xì)胞研究中逐漸被應(yīng)用和關(guān)注[11]。此外，針對(duì)完全克隆的研究切入時(shí)間與方式也需要注意。在本研究中，典型的完全克隆在單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)1～2周時(shí)形成，最好不要超過(guò)3周；擴(kuò)增培養(yǎng)后，可使癌干細(xì)胞比例減少或分化細(xì)胞比例增加，從而影響對(duì)癌干細(xì)胞行為學(xué)的觀察。

本研究屬于尋找舌癌干細(xì)胞的前期性和階段性實(shí)驗(yàn)，但是結(jié)果很有意義，這12個(gè)細(xì)胞亞系表明了Tca8113M1細(xì)胞系中有存在舌癌干細(xì)胞的可能性，而其最初的來(lái)源細(xì)胞系Tca8113也應(yīng)存在癌干細(xì)胞。結(jié)合細(xì)胞克隆形態(tài)分析的單個(gè)癌細(xì)胞培養(yǎng)模式可為深入研究舌癌干細(xì)胞提供細(xì)胞研究平臺(tái)。

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（本文編輯 吳愛(ài)華）