劉錫紅，趙靈希，張成杰，劉 虹，覃 瑞，熊海容，*

（1.中南民族大學南方少數(shù)民族地區(qū)生物資源保護及綜合利用工程中心，湖北武漢430074；2.武漢新華揚生物股份有限公司，湖北武漢430000）

目前工業(yè)化生產甲殼素的原料主要是蝦、蟹殼，2006年我國對蝦養(yǎng)殖產量已高達156×104t左右，目前我國的對蝦產品主要以出口為主，而出口產品又以無頭對蝦（蝦仁）為主。對蝦的蝦頭和蝦殼占整個蝦質量的30%～40%，在對蝦的加工過程中會產生大量的蝦頭和蝦殼下腳料[1]。目前工業(yè)上去除蝦殼中蛋白質的主要方法是采用稀NaOH溶液熬煮蝦殼，熬煮液經(jīng)HCl中和后回收其中的蛋白質，固體物質經(jīng)KMnO4氧化，再用NaHSO3還原，水洗干燥得到甲殼素[2-4]。采用這一方法，堿液及熱能消耗大，易產生廢液廢水，環(huán)境污染嚴重，雖可以實現(xiàn)蛋白質的回收利用，但利用率和價值都較低，工序復雜[5]。采用酶法脫蛋白可降低有機試劑的用量，縮短提取時間，效果比常規(guī)方法好，而且酶法脫蛋白化學試劑用量少，蛋白質回收容易。如果采用蛋白酶水解的方式脫除蝦殼中的蛋白質，不僅條件溫和，工藝簡單，廢水廢液少，而且可實現(xiàn)節(jié)能減排，因此是一種值得研究和推廣的綠色加工技術。本實驗利用蛋白酶去除蛋白質收獲甲殼素，避免了堿法對環(huán)境造成的污染。蝦頭和蝦殼中殘留有大量的蛋白質，另外還有多不飽和脂肪酸、VE、蝦青素和各種礦物質等成分，營養(yǎng)價值很高。利用蛋白酶水解蝦頭和蝦殼，可以將其中的蛋白質水解為短肽、氨基酸等，所得水解液經(jīng)噴霧干燥可制成蛋白粉，或者經(jīng)調配制成蝦油[1]。本論文采用不同蛋白酶水解脫鈣蝦殼，研究了酶解的條件及酶解對甲殼素微觀表面狀態(tài)的影響，選出最合理的蛋白酶及其水解條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蝦殼 購自浙江海鮮市場，經(jīng)過挑選除雜、清洗和干燥后，粉碎混勻，儲藏備用；標準甲殼素樣品Sigma公司，色譜純；堿性蛋白酶、酸性蛋白酶 源葉生物；胰蛋白酶、木瓜蛋白 BIOSHARP公司；NaOH（分析純）、硼酸（化學純）、硼砂（化學純） 國藥集團試劑有限公司；福林酚試劑 北京鼎國生物技術有限公司；干酪素 源葉生物；L-酪氨酸 Sigma公司；其他化學藥品 均為分析純。

RK1028型超聲波清洗儀 德國BANDELIN公司；JA2003型電子分析天平 HANGPING公司；722型紫外可見分光光度計 UNICO公司；半微量凱氏定氮儀 上海申立儀器有限公司；低溫超高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；jsm6510型電子掃描顯微鏡 日本；E-1010型離子濺射儀 HITACHI；粉碎機 上海速邦。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 酶法改良甲殼素制備工藝流程：蝦殼→預處理→稀鹽酸脫碳酸鹽→水洗至中性→蛋白酶脫除蛋白質→水洗至中性→干燥→脫色→甲殼素。

1.2.2 操作步驟

1.2.2.1 預處理 蝦殼經(jīng)分檢去雜后浸入40℃溫水15min，去除雜質，撈取蝦殼用清水反復沖洗至無浮液并瀝干待用。

1.2.2.2 烘干 將清洗好的蝦殼置于鼓風干燥箱中干燥，干燥溫度為80℃，時間8h。

1.2.2.3 粉碎 對達到干燥要求的蝦殼，用粉碎機進行粉碎至所需粒度。

1.2.2.4 稀鹽酸脫碳酸鹽 將烘干的蝦殼用0.25mol/L HCl在室溫下攪拌處理30min[6]。

1.2.2.5 酶解 將蝦殼和蒸餾水加入玻璃容器里，用2%氫氧化鈉調節(jié)pH至蛋白酶最適pH，再加入蛋白酶粉，水浴鍋預熱至蛋白酶最適溫度，在恒溫攪拌器的條件下進行反應。

1.2.3 酶活力的測定 采用Folin顯色法[7]，測OD680nm值并計算酶活力。酶活定義為1g固體酶粉（或1mL液體酶），在一定溫度和pH條件下，1min水解酪素產生1μg酪氨酸為1個酶活力單位，以U/g（U/mL）表示。

1.2.4 蝦殼常規(guī)指標的測定

1.2.4.1 水分測定 采用105℃恒重法[8]。

1.2.4.2 脂肪含量的測定 采用索氏抽提法測定[9]。

1.2.4.3 灰分含量的測定 采用550℃干法灰化法測定[10]。

1.2.4.4 甲殼素化學制備方法 稱取10g蝦殼粉，用5%鹽酸溶液浸泡至無氣泡產生，洗滌至中性，烘干，用10%氫氧化鈉在沸水浴中浸泡1～2h，洗滌至中性，烘干。其中脫蛋白與脫鈣處理重復2～3次。進行脫色，得到白色甲殼素，稱取質量[11]。

1.2.4.5 蛋白質含量的測定 稱取5g粉碎的蝦殼，加人30mL質量分數(shù)為4%的NaOH溶液，于溫度95℃下水浴浸泡60min，離心分離，濾渣重復上述實驗，合并上清液，用凱氏定氮法測定上清液中的蛋白質含量[1]。

1.2.5 樣品總氮含量的測定 采用食品安全國家標準測定食品中蛋白質含量[12]。

1.2.6 蛋白質水解率的測定 公式如下：

式中：X-試樣中蛋白質的水解率；A-原材料蝦殼中的總氮；B-酶法水解后收獲物的總氮；C-酸堿法水解蝦殼獲得的甲殼素的總氮。

1.2.7 水解用蛋白酶的選擇 分別采用堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶水、胰蛋白酶解粉碎成20目蝦殼，加酶量10000U/g，在酶的最適反應條件（見表1）下反應5h，底物質量濃度為2g/100mL，比較四種酶的水解率大小。

表1 酶的最適反應溫度、pHTable 1 The optimal temperature and pH of enzymes

1.2.8 酶解時間的選擇 加水到粉碎成20目的蝦殼中，底物質量濃度為2g/100mL，添加堿性蛋白酶5000U/g，于溫度60℃保溫水解24h，pH為8.5，反應過程中分別在第2、3、4、5、6、7、10、24h取樣測定其水解率。

1.2.9 酶用量的選擇 加入水到粉碎成20目的蝦殼中，底物濃度為2g/100mL，堿性酶用量分別為2000、3000、4000、5000、6000、7000U/g，于溫度60℃保溫水解5h，pH為8.5，反應結束后，測定水解率。

1.2.10 最佳底物濃度的選擇 加不同量的水到粉碎成20目的蝦殼中，使底物質量濃度分別為1、2、2.5、3、3.5g/100mL，添加堿性蛋白酶5000U/g，于溫度60℃保溫水解5h，pH為8.5，反應結束測定水解度。

1.2.11 蝦頭、蝦殼殼破碎粒度的選擇 將蝦殼分別粉碎成過20目篩、過40目篩和過80目篩，底物質量濃度為2g/100mL，加入5000U/g堿性蛋白酶，于溫度60℃保溫水解5h，pH為8.5，反應結束后測定水解率。

1.2.12 脫色方法 將前述工藝所得的蝦殼在3%KMnO4溶液中，固液比為1∶10，常溫下處理0.5h，后換用1%草酸溶液，固液比為1∶20，在70℃水浴中處理15min或常溫下處理5h[13]。

1.2.13 甲殼素的表征與特性分析 采用jsm6510-EDAX（日本）電子掃描顯微鏡對甲殼素標準品、化學法甲殼素樣品和酶法甲殼素樣品表征進行檢測。用HITACHI E-1010離子濺射儀在觀察面上鍍金后，在3000倍數(shù)下對試樣甲殼素標準品、化學法甲殼素樣品和酶法甲殼素樣品進行表面形貌的觀察[14]。

2 結果與討論

2.1 蝦殼基本成分

經(jīng)測定，蝦殼中各成分含量為：水分6.4%，粗蛋白40.9%，粗脂肪7.2%，灰分11.7%，其余部分主要為甲殼素。

2.2 酶活力的測定結果

4種蛋白酶酶活力的測定結果見表2。

表2 酶活力測定結果Table 2 The results of enzyme activity

由表1可知，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的酶活力相對較低，堿性蛋白酶和酸性蛋白酶的酶活力都比較高。

2.3 蛋白酶的確定

4種酶的水解率見圖1。

圖1 酶種類對水解率的影響Fig.1 The effect of different kinds of enzyme on hydrolysis rate

由圖1可知，酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解效果最差，水解率相對較低，堿性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解效果最好，水解率都比較高。考慮到堿性蛋白酶的水解率略高于胰蛋白酶，而且胰蛋白酶的價格昂貴，且綜合表1結果的堿性蛋白酶的酶活力相對較高，選擇堿性蛋白酶進行進一步的研究。

2.4 酶解條件的確定

2.4.1 酶解時間的確定 酶解時間對水解效果的影響見圖2。

圖2 酶解時間對酶解效果的影響Fig.2 The effect of time on hydrolysis rate

由圖2可知，酶解液的水解率隨著酶解時間延長而逐漸增加，在前2h增長速度極快，酶解到第7h反應便逐漸趨于平衡，繼續(xù)延長酶解時間，水解率增加較少，考慮到生產效率問題，選擇酶解時間6h為宜。

2.4.2 酶用量的確定 酶用量對酶解效果的影響見圖3。

圖3 酶用量對酶解效果的影響Fig.3 The effect of enzyme dosage on hydrolysis rate

由圖3可知，堿性蛋白酶用量在2000～7000U/g的情況下，隨著酶用量的增加，酶解液的水解率逐漸增大，當堿性蛋白酶用量超過5000U/g后，水解效果提高并不明顯，因此，從減少成本的角度考慮，選擇采用堿性蛋白酶用量為5000U/g。

2.4.3 最佳底物質量濃度的確定 最佳底物質量濃度對酶解效果的影響見圖4。

圖4 底物質量濃度對酶解效果的影響Fig.4 The effect of concentration of substrate on hydrolysis rate

由圖4可知，隨著底物質量濃度的增大，水解率也增大，當?shù)孜镔|量濃度為2.0g/100mL時，水解效果趨于平衡，當?shù)孜餄舛雀哂?.0g/100mL時，對水解率產生一定的影響。但在生產中采用高底物濃度使得單位時間和單位容積的反應器收得量更高，因此實際生產過程中，可以選擇3.0～3.5g/100mL的底物質量濃度，本實驗則選用2.0g/100mL進行后續(xù)實驗。

2.4.4 蝦殼破碎粒度的確定 蝦殼破碎粒度對酶解效果的影響見圖5。

由圖5可知，過80目篩的蝦殼水解效果最好，但三個破碎度之間的水解率差異不顯著（p＞0.05），從后期處理的簡化考慮，選擇過20目篩的蝦殼進行后續(xù)實驗。

2.5 脫色效果

甲殼素的脫色，主要是將甲殼素的顏色去除，使甲殼素顏色變淺，提高產品價值。在脫色前，甲殼素不宜粉碎成較小顆粒，以免被氧化降解，形成更小顆?；蚣毞勰?，影響產物回收率，降低得率[15]。

將脫鈣和脫蛋白質后的蝦殼在分別經(jīng)過3%KMnO4溶液和1%草酸溶液處理。實驗顯示脫色效果良好，所得甲殼素蓬松，色澤半透明，且白晳、均一。

圖5 蝦殼破碎粒度對酶解效果的影響Fig.5 The effect of particle size on hydrolysis rate

2.6 甲殼素的表征與特性分析

根據(jù)Gershecker[16]的工作及研究表明，甲殼由表殼層、外殼層、含鈣內殼層及非含鈣內殼層組成。真皮層位于含鈣內殼層內，真皮層內的色素細胞分泌黑色素。表殼層由酚類、脂肪、蛋白質所組成的薄膜狀結構，在甲殼體表面起到類似涂層的保護作用[15]。

本研究比較了脫鈣后蝦殼經(jīng)化學法脫蛋白及采用堿性蛋白酶水解蛋白后的電鏡照片，并與甲殼素標準品作對比，結果見圖6～圖8。

圖6～圖7分別為甲殼素標準品和傳統(tǒng)化學工藝制備的甲殼素的掃描電鏡圖，從圖中可知，脫蛋白后，樣品表面較為光滑，說明蛋白質、鈣和脂肪已被基本除去，剩下的主要為甲殼素。圖8為酶法改良工藝制備的甲殼素的掃描電鏡圖，可以看到甲殼素的組織結構，表面為網(wǎng)狀結構，圖中白點應是真皮層內的色素細胞分泌出的色素顆粒，表面很平整，說明蛋白質、脂肪和鈣已基本被除去。比較從三種甲殼素的掃描電鏡照片，可認為本實驗采用的由蝦殼制備甲殼素的工藝是合理的。

圖6 甲殼素標準品電鏡掃描圖（×3000）Fig.6 SEM photographs of chitin standard substance（×3000）

圖7 化學法甲殼素樣品電鏡掃描圖（×3000）Fig.7 SEM photographs of chitin samples from chemical method（×3000）

圖8 酶法甲殼素樣品電鏡掃描圖（×3000）Fig.8 SEM photographs of chitin samples from enzyme method（×3000）

2.7 驗證實驗

向粉碎成20目的蝦殼中加入5000U/g的堿性蛋白酶，底物質量濃度為2g/100mL，pH為8.5，于溫度60℃保溫水解6h，在此條件下，水解率達到78.3%。

3 討論

一直以來，甲殼素的制備工藝以化學方法為多，化學方法雖然試劑易得，但是存在反應條件劇烈、設備要求高、產品質量差、容易造成環(huán)境污染等缺點。而采用酶法脫蛋白可降低試劑的用量，縮短提取時間，效果比化學方法好，而且酶法脫蛋白化學試劑用量少，蛋白質容易回收。后續(xù)實驗還可以將其中的蛋白質水解為短肽、氨基酸等，將所得水解液經(jīng)噴霧干燥制成蛋白粉，或者經(jīng)調配制成蝦油。進一步分析蝦殼蛋白質水解液的多肽成分和多肽含量也是非常有價值的工作。

如果直接采用凱氏定氮法測定蝦殼和蝦頭中蛋白質是不合理的，因為蝦殼中含有大量的甲殼素，而甲殼素中含有豐富的氮，如果直接將其消化后測定，則甲殼素中的氮也被計算到蛋白質中，導致蛋白質測定值嚴重偏離實際含量。還有一些實驗通過甲醛法測定氨基態(tài)氮的含量來測定水解度，由于實驗過程中要監(jiān)測體系pH的變化，較為繁瑣復雜。因此，本實驗首先用凱氏定氮法分別測定蝦殼中總氮含量和用化學法制得的甲殼素中總氮的含量，再對酶法制備的甲殼素進行總氮含量的測定，通過1.2.6中的公式進行水解率的計算，從而既避免了甲殼素氮對蛋白質的測定量的影響，又簡化了實驗步驟。

4 結論

甲殼素是一種資源豐富，而且是存在于自然界中的唯一一種帶陽離子能生物降解的高分子材料，甲殼素及其衍生物具有不污染環(huán)境、物理化學性質和生物特征優(yōu)異的特點，在化工、紡織、印染、造紙、醫(yī)藥、環(huán)境保護、化妝品等領域都有廣泛的應用前景。

本研究表明，酶法去除蝦殼中蛋白質的最佳條件為：向粉碎成20目的蝦殼中加入5000U/g的堿性蛋白酶，底物質量濃度為2g/100mL，pH為8.5，于溫度60℃保溫水解6h，在此條件下，水解率達到78.3%。通過掃描電鏡分析測試，比較了甲殼素標準品、化學法甲殼素樣品和酶法甲殼素樣品的電鏡掃描照片，可認為本實驗采用的由蝦殼制備甲殼素的工藝是合理的。

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