徐晤，王志榮，李思召，張超群，李飛，周召峰，張卓琦

心房顫動(dòng)是常見病和多發(fā)病，嚴(yán)重危害著公眾健康，花費(fèi)較多[1]。目前心房顫動(dòng)的藥物治療不盡理想，對(duì)于心房顫動(dòng)發(fā)生和預(yù)防的研究，具有很重要的臨床意義。心房顫動(dòng)時(shí)存在的心房重構(gòu)包括電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)，同時(shí)伴有腎素－血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的激活[2]。本實(shí)驗(yàn)通過快速右心房起搏構(gòu)建豬的心房顫動(dòng)模型，觀測心房顫動(dòng)時(shí)心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)和心房肌組織中膠原蛋白-I和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）的表達(dá)及其變化，探討它們之間的關(guān)系。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:實(shí)驗(yàn)時(shí)間2010-01至2011-06，健康小型家豬18只，雌雄不限（所有的動(dòng)物均由徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），3～4個(gè)月齡，體重（37.4±2.5）kg。先行編號(hào)，按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)均分成3組，每組6只:正常對(duì)照組，植入電極不起搏；快速起搏組，植入電極并快速右心房起搏；替米沙坦組，快速右心房起搏并給予替米沙坦60mg/（kg·d）喂養(yǎng)。

模型制備:本實(shí)驗(yàn)參考Chen等[3]采用的方法并加以改良以快速右心房起搏建立心房顫動(dòng)模型。簡述之，以3%戊巴比妥鈉麻醉，采用Seldinger血管穿刺技術(shù)穿刺右側(cè)頸內(nèi)靜脈，3組植入心房單極起搏電極(美國Medtronicstreamline)，用起搏分析儀測量起搏參數(shù)滿意（電壓閾值＜1 V，阻抗500～1000 Ω）后，連接實(shí)驗(yàn)高頻心臟起搏器并埋置于右側(cè)鎖骨上區(qū)。

參數(shù)設(shè)定:起搏方式為AOO，脈沖頻率520次/分，脈沖幅度≥5 V，脈沖寬度0.15 ms，經(jīng)磁鐵啟動(dòng)并測試滿意后埋置起搏器。術(shù)后予頭孢唑啉鈉3.0 g肌肉注射抗感染4天，每日觀察豬的進(jìn)食進(jìn)水情況，特別注意起搏器植入部位有無滲血、血腫、皮膚破潰。持續(xù)起搏2周，每周記錄一次標(biāo)準(zhǔn)肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖檢查起搏狀態(tài)。

心房顫動(dòng)的誘導(dǎo)及持續(xù)時(shí)間的觀察:各組于實(shí)驗(yàn)開始及2周結(jié)束時(shí)均行電生理檢查:經(jīng)高位右心房電極行期前程序刺激和短陣快速（Burst）刺激進(jìn)行心房顫動(dòng)的誘發(fā)。①期前程序刺激的驅(qū)動(dòng)周長(S1S1)為300 ms，S1S2間期為心房有效不應(yīng)期加上50 ms，步長5 ms反掃直至不應(yīng)期。如果不能誘發(fā)心房顫動(dòng)則引入S3， S2S3間期從S1S2的80%開始，步長5 ms反掃直至S3落入不應(yīng)期，若仍不能誘發(fā)心房顫動(dòng)則引入S4。②若S4也未能誘發(fā)心房顫動(dòng)，則采用12 Hz，脈寬2 ms， 4倍閾值的短陣快速刺激（l0 s）誘導(dǎo)，記錄刺激時(shí)心房顫動(dòng)誘發(fā)的情況及持續(xù)時(shí)間。參照既往文獻(xiàn)[4]，把持續(xù)時(shí)間大于15 min的心房顫動(dòng)定義為持續(xù)性心房顫動(dòng)。如果實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)持續(xù)不能自行終止的房性心動(dòng)過速或心房顫動(dòng)，觀察45 min后如不能自動(dòng)恢復(fù)則進(jìn)行電轉(zhuǎn)復(fù)，復(fù)律后暫停30 min再重新進(jìn)行刺激。

超聲測量豬心室收縮末期左心房面積（LAESA）、右心房面積（RAESA）:檢查前用磁鐵關(guān)閉起搏器，使用便攜式超聲機(jī)（Philips，美國），探頭的頻率為2～4 MHz，分別在起搏前及起搏2周后采用面積—長度法測量LAESA、RAESA，測量參數(shù)取3個(gè)心動(dòng)周期的平均值。

形態(tài)學(xué)觀察:取豬心肌組織數(shù)塊，置10%中性福爾馬林溶液固定，梯度酒精系列脫水， 常規(guī)石蠟包埋，切成5 μm厚，并行蘇木素伊紅（HE）染色、馬松（Masson）染色和免疫組化染色。按照公司試劑說明操作，光鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)、膠原纖維及其ACE2，拍片，掃描，采用圖像分析儀定量心肌組織膠原及ACE2含量。

ACE2和膠原蛋白-I的蛋白質(zhì)印跡法（Westen blot）檢測:100mg心房肌組織加0.5ml裂解液，超聲粉碎后勻漿，離心后lowry法測蛋白濃度。取40 μg總蛋白聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳（80 V 20～30 min，120 V 1～1.5 h），轉(zhuǎn)膜（10 V，1.5 h），封閉非特異抗原，分別加入膠原蛋白-I和ACE2抗體4℃過夜，再加二抗37℃ 2 h；漂洗、顯色、光密度掃描分析光密度，分別計(jì)算ACE2和膠原蛋白-I相對(duì)含量。

獲得的目標(biāo)蛋白條帶OD值與內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GADPH）條帶OD值相比獲得數(shù)據(jù)。GADPH是參與糖酵解的一種關(guān)鍵酶，由4個(gè)30～40 KD的亞基組成，分子量146 KD，檢測條帶大約在36 KD。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組內(nèi)的前后比較用配對(duì)的t檢驗(yàn)；多組比較采用單因素方差分析（ANONA），組間的兩兩比較用q檢驗(yàn)（SNK法），兩計(jì)量資料相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson相關(guān)分析；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 豬心房顫動(dòng)模型的建立及心房顫動(dòng)的誘發(fā)

起搏前，3組豬程序刺激和Burst（500次/分）刺激均未誘發(fā)出心房顫動(dòng)?？焖倨鸩M和替米沙坦組快速起搏2周后關(guān)閉起搏器，快速起搏組有1只豬表現(xiàn)為持續(xù)的心房顫動(dòng)，另外5只豬用程序刺激或Burst刺激均可誘發(fā)出心房顫動(dòng)，心房顫動(dòng)誘發(fā)率為100%，快速起搏組有5只豬可誘發(fā)超過15 min的心房顫動(dòng)，平均時(shí)間（26.41±9.89）min。替米沙坦組有4只豬誘發(fā)出＜15 min的心房顫動(dòng)，平均時(shí)間（9.57±2.50）min，2只豬未誘發(fā)出來心房顫動(dòng)；替米沙坦組與快速起搏組比較心房顫動(dòng)持續(xù)時(shí)間縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01）。正常對(duì)照組誘發(fā)情況同術(shù)前無變化。

2.2 起搏前后心臟超聲結(jié)果（表1）

表1 實(shí)驗(yàn)前后各組心臟超聲結(jié)果(mm2，)

表1 實(shí)驗(yàn)前后各組心臟超聲結(jié)果(mm2，)

注:與正常對(duì)照組比較＊P＜0.05，與快速起搏組比較△P＜0.05，與同組起搏前比較▲P＜0.05

組別 心室收縮末期左心房面積 心室收縮末期右心房面積起搏前 起搏2周后 起搏前 起搏2周后正常對(duì)照組 569.8±16.6 572.4±17.1 495.5±19.9 498.7±18.3快速起搏組 573.1±14.9 744.3±29.9＊ 497.9±12.2 677.9±26.3＊替米沙坦組 571.4±21.1 630.6±10.9＊△▲ 499.1±29.3 553.4±13.7＊△▲只數(shù)666

起搏前后使用美國SONOHEART便攜式超聲機(jī)測量LAESA、RAESA。起搏前，3組LAESA和RAESA分別比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；起搏2周后，快速起搏組和替米沙坦組LAESA和RAESA均較正常對(duì)照組大（P＜0.05），替米沙坦組LAESA和RAESA均較快速起搏組縮小（P＜0.05），替米沙坦組LAESA和RAESA起搏2周后較起搏前增大（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 形態(tài)學(xué)觀察

豬右心房組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果:蘇木素伊紅染色（圖1）顯示，快速起搏組心肌細(xì)胞排列紊亂，組織結(jié)構(gòu)破壞，可見明顯的間質(zhì)纖維化。替米沙坦組較快速起搏組明顯好轉(zhuǎn)，心肌細(xì)胞排列較規(guī)整，細(xì)胞核較規(guī)則，可見少量纖維組織填充。馬松染色（圖2）顯示，替米沙坦組心房肌組織膠原陽性染色較快速起搏組明顯減少，主要位于血管周圍和心肌細(xì)胞間質(zhì)。

2.4 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2免疫組化染色（圖3）

圖1～3 豬右心房組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果。1為蘇木素伊紅染色 2為馬松染色 3為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2免疫組化染色。A為正常對(duì)照組 B為快速起搏組 C為替米沙坦組

正常對(duì)照組心房肌ACE2陽性顆粒較多，快速起搏組心房顫動(dòng)心房肌陽性染色明顯減少，替米沙坦組予替咪沙坦干預(yù)后心房肌ACE2陽性顆粒明顯增多。

2.5 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2和膠原蛋白-I 的蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果

快速起搏組ACE2含量明顯低于正常對(duì)照組、替米沙坦組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）?？焖倨鸩M膠原蛋白-Ⅰ含量明顯高于正常對(duì)照組、替米沙坦組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 5）。

圖4 、圖5 蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果。4為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶295 KD 5為膠原蛋白-I 90 KD。A為正常對(duì)照組 B為快速起搏組 C為替米沙坦組

2.6 Pearson 相關(guān)分析

RAESA與膠原蛋白-I呈正相關(guān)（r=0.956，P＜0.01），RAESA與ACE2、ACE2與膠原蛋白-I均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.966，r=-0.948，P＜0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

通過快速右心房起搏建立持續(xù)性心房顫動(dòng)模型。既往有應(yīng)用乙酰膽堿等藥物及造成二尖瓣反流等建立的心房顫動(dòng)模型，但不能模擬心房顫動(dòng)真實(shí)發(fā)病過程及特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以Chen等[3]的方法為基礎(chǔ)加以改良，采用閉胸法通過快速右心房起搏建立持續(xù)性心房顫動(dòng)豬動(dòng)物模型，更接近心房顫動(dòng)的病理生理狀態(tài)。右心房以500次/分的起搏頻率起搏2周后，觀察到1只豬出現(xiàn)持續(xù)性心房顫動(dòng)；經(jīng)程序刺激或Burst刺激，心房顫動(dòng)誘發(fā)率可達(dá)100%，其中快速起搏組83.3%的豬可誘發(fā)出持續(xù)時(shí)間＞15 min的心房顫動(dòng)。該方法操作簡便、成功率高、可重復(fù)性好，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

心房顫動(dòng)時(shí)心房病理形態(tài)學(xué)變化及結(jié)構(gòu)重構(gòu)。在沒有電重構(gòu)、心房擴(kuò)張和心力衰竭的情況下，單純的心房纖維化足以促進(jìn)心房顫動(dòng)的發(fā)生[5]。賈紅丹等[6]發(fā)現(xiàn)風(fēng)濕性心臟病伴慢性心房顫動(dòng)患者心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)以心肌纖維化為主要特征，心房顫動(dòng)患者左、右心房血管緊張素Ⅱ受體表達(dá)不平衡，且較竇律者組有升高趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)病理形態(tài)學(xué)顯示，心房顫動(dòng)模型心肌細(xì)胞排列紊亂，組織結(jié)構(gòu)破壞，可見明顯的間質(zhì)纖維化以及脂肪組織浸潤，間質(zhì)膠原沉積，各型膠原比例失調(diào)和排列紊亂，這些病理學(xué)改變?yōu)樾姆款潉?dòng)的發(fā)生和持續(xù)提供了病理生理方面的物質(zhì)基礎(chǔ)，快速心房起搏會(huì)導(dǎo)致心房的進(jìn)行性擴(kuò)大。

心房顫動(dòng)時(shí)腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活及心房纖維化，替米沙坦干預(yù)對(duì)心房顫動(dòng)時(shí)心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的影響。腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活在心房顫動(dòng)心房間質(zhì)纖維化的發(fā)生中起重要作用[7]。在心肌梗死后的心室肌內(nèi)，血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1）受體阻滯劑氯沙坦、奧美沙坦恢復(fù)了血管緊張素Ⅱ1型受體的正常表達(dá)，同時(shí)增加了ACE2的表達(dá)[8]。ACE2的表達(dá)能部分抵抗血管緊張素 II誘導(dǎo)的心肌肥厚和纖維化[9]。我們前期研究結(jié)果示[10]:替米沙坦可提高慢性心房顫動(dòng)心房ACE2的表達(dá)，抑制慢性心房顫動(dòng)的心房纖維化。本結(jié)果顯示豬經(jīng)過快頻率心房起搏2周后，心房顫動(dòng)的誘發(fā)率顯著增加，并且持續(xù)時(shí)間明顯延長；病理學(xué)證實(shí)發(fā)生了明顯間質(zhì)纖維化?？焖傩姆科鸩T導(dǎo)的豬心房顫動(dòng)模型的心房組織的ACE2表達(dá)下降可能是導(dǎo)致膠原蛋白-I表達(dá)增加、心房纖維化的重要機(jī)制之一。替米沙坦能有效降低心房纖維化，抑制豬慢性心房顫動(dòng)模型結(jié)構(gòu)重構(gòu)的發(fā)生，進(jìn)而為替米沙坦治療心房顫動(dòng)提供了新的理論依據(jù)。

[1] Naccarelli GV, Johnston SS, Lin J, et al. Cost burden of cardiovascular hospitalization and mortality in ATHENA-like patients with atrial fibrillation/atrial flutter in the United States. Clin Cardiol，2010，33:270-279.

[2] Healey JS, Morillo CA, Connolly SJ. Role of the renin-angiotensinaldosterone system in atrial fibrillation and cardiac remodeling. Curr Opin Cardiol， 2005,20:31-37.

[3] Chen CL, Lin JL, Lai LP, et al. Altered expression of FHL1, CARP,TSC-22 and P311 provide insights into complex transcriptional regulation in pacing-induced atrial fibrillation. Biochim Biophys Acta，2007, 1772: 317-329.

[4] Laurent G, Moe G, Hu X, et al. Experimental studies of atrial fibrillation: a comparison of two pacing models. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，294:H1206-1215.

[5] Schotten U, Verheule S, Kirchhof P, et al. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiol Rev，2011，91:265-325.

[6] 賈紅丹，李曦銘，李作成，等. 風(fēng)濕性心臟病伴發(fā)心房顫動(dòng)及竇性心律患者血管緊張素Ⅱ受體在左、右心房中的不平衡表達(dá). 中國循環(huán)雜志，2010，25:201-204.

[7] Li Y, Li W, Yang B, et al. Effects of Cilazapril on atrial electrical,structural and functional remodeling in atrial fibrillation dogs. J Electrocardiol， 2007，40:100.

[8] Ishiyama Y, Gallagher PE, Averill DB, et al. Upregulation of angiotensin -converting enzyme 2 after myocardial infarction by blockade of angiotensin II receptors. Hypertension, 2004,43:970-976.

[9] Keidar S, Kaplan M, Gamliel-Lazarovich A. ACE2 of the heart:From angiotensin I to angiotensin (1-7). Cardiovasc Res，2007,73:463-469.

[10] 譚偉，張超群，徐晤，等. 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 在心房顫動(dòng)心房纖維化中的作用.中國循環(huán)雜志，2011，26:306-309.