劉麗霞，殷 宏，田世民，鐘 理

(1河北大學(xué)研究生學(xué)院，河北保定071002;2中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院綜合檢測(cè)中心毒理實(shí)驗(yàn)室，質(zhì)檢總局毒理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

環(huán)境雌激素是指環(huán)境中存在的具有雌激素特征的一類(lèi)內(nèi)分泌擾亂物質(zhì)。雙酚 A(bisphenol A，BPA)是環(huán)境雌激素的一種，為弱雌激素拮抗劑，可結(jié)合于雌激素受體上，最終導(dǎo)致機(jī)體性別分化的改變、青春期提前、發(fā)情周期改變、垂體分泌能力的改變、生殖能力下降等危害［1］。其目前廣泛用于罐頭食品和飲料的包裝、奶瓶及水瓶等塑料日用品及牙封閉劑中［2］。神經(jīng)生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)主要由下丘腦—垂體—性腺軸(HPG)進(jìn)行調(diào)控。近年來(lái)大量實(shí)驗(yàn)證明，類(lèi)固醇激素通過(guò)直接作用于新發(fā)現(xiàn)的一組神經(jīng)肽:Kisspeptin及促性腺激素抑制激素(GnIH)，對(duì)生殖軸進(jìn)行調(diào)控。2012年3～8月，我們以去卵巢雌性大鼠為動(dòng)物模型，利用Real-Time PCR方法檢測(cè)了BPA對(duì)大鼠間腦組織中Kisspeptin、GnIH及其各自受體mRNA表達(dá)量的影響。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SPF級(jí)成年雌性SD大鼠16只，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào):SCXK(京)2012-0001］。飼養(yǎng)條件為晝夜12 h交替，室內(nèi)溫度控制于20～25℃，濕度40%～70%，食水自由攝?。蹖?shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)碼:SYXK(京)2011-0016］。BPA(日本和光公司);雌二醇(Sigma公司);總RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司);反轉(zhuǎn)錄及熒光定量試驗(yàn)使用Promega公司的Go Taq 2-Step RT-qPCR System試劑盒。熒光定量反應(yīng)所用儀器為Applied Biosystems 7500。

1.2 去卵巢雌性大鼠模型制備、分組及干預(yù) 模型制備參照文獻(xiàn)［3］，于乙醚麻醉下行卵巢摘除手術(shù)，手術(shù)結(jié)束后動(dòng)物恢復(fù)1周，將其隨機(jī)分為四組各4只，分別為陰性對(duì)照組、BPA低劑量組、BPA高劑量組、雌二醇處理組。BPA高劑量組采用其最大耐受劑量［1 g/kg body weight(BW)·d］的 1/10(100mg/kg BW·d)，低劑量組為高劑量組的1/10。用乙醇溶解BPA后，橄欖油稀釋?zhuān)凑?.5 mL/kg BW·d進(jìn)行腹腔注射。陰性對(duì)照組予橄欖油0.5 mL/kg BW·d，雌二醇處理組予雌二醇1mg/kg BW·d，每日給藥1次，連續(xù)給藥3 d，給藥結(jié)束1周之后乙醚麻醉下解剖動(dòng)物，取雙角子宮及間腦［4］，剔除多余脂肪組織，稱(chēng)量各臟器的重量，記錄并計(jì)算臟器系數(shù)(臟器重量/體重×100%)。將所取臟器迅速投于液氮中速凍，-80℃保存。臟器重量及臟器系數(shù)的結(jié)果顯示，與去卵巢陰性對(duì)照組相比，雌二醇處理組動(dòng)物子宮的重量及臟器系數(shù)顯著增加，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中去卵巢雌性大鼠模型構(gòu)建成功［3］。

1.3 間腦中 Kisspeptin、GPR54、GnIH 與 GPR147基因mRNA測(cè)定方法 按照Trizol法使用說(shuō)明提取組織總RNA，根據(jù)OD260/OD280的值測(cè)定RNA的質(zhì)量，計(jì)算總 RNA的濃度。用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水將RNA稀釋至終質(zhì)量濃度100 ng/μL。以上述RNA為模板，Oligo(dT)15為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL。試驗(yàn)流程按照Promega公司的兩步法RT-qPCR試劑盒中的反轉(zhuǎn)錄部分進(jìn)行。相對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn):內(nèi)參基因?yàn)榇笫螃?actin，登錄號(hào) NW_048034，引物序列(5'→3')為 F-AGATGACCCAGATCATGTTTGAGA，R-ACCAGAGGCATACAGGGACAA;目的基因分別為大鼠Kisspeptin及其受體 GPR54、大鼠GnIH及其受體GPR147四種基因，其登陸號(hào)分別為NW_047395、NW_047773、NW_047691、NW_047601，引物序列(5'→3')分別為:F-ATGATCTCGCTGGCTTCTTGG，RGGTTCACCACAGGTGCCATTTT;F-GCTGGGAGACTTCATGTGCAA，R-AGCGGGAA CACAGTCACATACC;F-GAGTCCTGGTCAAGAGCAAC，R-ACTGGCTGGAGGTTTCCTAT;F-CGCTCCTACCCGCTCTACT，RAGCGGCACCAGGTAGATGT。擴(kuò)增采用 SYBR Green法，引物設(shè)計(jì)參考 Quennell等［5］的報(bào)告。試驗(yàn)流程按照Promega公司的兩步法RT-qPCR試劑盒中的qPCR部分進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)?95℃ 2min，95℃ 15 s，60℃ 1min;40個(gè)循環(huán);溶解曲線程序:95 ℃ 15 s，60 ℃ 1min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。相對(duì)熒光定量PCR的分析方法為2-△△Ct法。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

四組動(dòng)物間腦組織中 Kiss1、GPR54、GnIH與GPR147基因mRNA表達(dá)見(jiàn)表1。

表1 四組動(dòng)物間腦組織中Kiss1、GPR54、GnIH與GPR147基因mRNA表達(dá)(±s)

表1 四組動(dòng)物間腦組織中Kiss1、GPR54、GnIH與GPR147基因mRNA表達(dá)(±s)

注:與陰性對(duì)照組相比，*P＜0.05，△P＜0.01

組別Kisspeptin GPR54 GnIH GPR147 BPA低劑量組 0.37±0.06△ 1.01±0.15 0.50±0.12△0.70±0.04 BPA高劑量組 0.50±0.20* 1.69±0.24△ 0.90±0.26 1.50±0.53雌二醇處理組 0.26±0.07△ 1.76±0.28△ 0.94±0.16 0.79±0.16陰性對(duì)照組1.02±0.24 1.00±0.11 1.03±0.28 1.03±0.30

3 討論

Kisspeptin是Kiss1基因的后翻譯產(chǎn)物之一，大鼠體內(nèi)的Kisspeptin序列為YNWNSFGLRF，其受體為G蛋白偶聯(lián)受體GPR54，促性腺激素釋放激素(GnRH)神經(jīng)元表達(dá) GPR54 的 mRNA［6，7］。GnIH 是2000年日本學(xué)者從鵪鶉的間腦中分離出的由下丘腦分泌的一種神經(jīng)肽，氨基酸序列為SIKPSAYLPLRF［8］，其受體(GnIH-r)為 OT7T022/GPR147，在大鼠腦內(nèi)33%GnRH神經(jīng)元表達(dá)GPR147［9］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Kisspeptin神經(jīng)元表達(dá)有雌激素受體 ERα［3］，雙標(biāo)記免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明，約40%GnIH免疫陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá) ERα［10］，Kisspeptin能夠激活 GnRH 及黃體生成素(LH)的分泌［4，7］，而 GnIH 具有抑制促性腺激素及 LH 分泌的功能［8，11］。

本試驗(yàn)建立了去卵巢雌性大鼠動(dòng)物模型，以排除動(dòng)物體內(nèi)雌激素對(duì)試驗(yàn)的干擾。關(guān)于雌激素對(duì)Kisspeptin/GnIH的影響已有一些報(bào)道，Quennell等給去卵巢雌性SD大鼠皮下包埋約含10 μg 17β-estradiol的橡膠管7 d后測(cè)定不同腦區(qū)內(nèi)Kisspeptin、GPR54、GnIH和 GPR147的mRNA水平，結(jié)果顯示與Kisspeptin基因相比，GnIH基因未見(jiàn)與雌激素有關(guān)的明顯改變［5］。本試驗(yàn)中雌二醇處理組結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，給去卵巢雌性大鼠雌二醇1mg/kg BW·d腹腔注射，連續(xù)給藥3 d，大鼠間腦組織內(nèi)Kisspeptin mRNA水平明顯降低，GPR54基因表達(dá)明顯升高，而GnIH和GPR147基因表達(dá)無(wú)顯著變化。

關(guān)于環(huán)境雌激素對(duì)Kisspeptin/GnIH的影響鮮有報(bào)道。本研究給予不同劑量的環(huán)境雌激素雙酚A，檢測(cè)了其對(duì)間腦內(nèi)Kisspeptin、GnIH及其各自受體mRNA表達(dá)量的變化。對(duì)于BPA對(duì)Kisspeptin mRNA表達(dá)的影響結(jié)果顯示，BPA低、高劑量組均顯著降低了間腦內(nèi) Kisspeptin基因的表達(dá)量;而GPR54的表達(dá)量在BPA高劑量組動(dòng)物間腦組織中顯著升高，低劑量組動(dòng)物間腦組織中無(wú)明顯變化。Kisspeptin免疫陽(yáng)性神經(jīng)元在嚙齒類(lèi)動(dòng)物腦中具有兩種主要類(lèi)型，一種存在于弓形核(ARC)，另一種存在于前腹室旁核(AVPV)中［12］。對(duì)去除卵巢的雌性小鼠及AcGFP轉(zhuǎn)基因小鼠給予E2，明顯增加了AVPV內(nèi)Kisspeptin基因的表達(dá)水平，顯著降低了ARC內(nèi)Kisspeptin基因的表達(dá)［13］。由本試驗(yàn)結(jié)果可推測(cè)在去卵巢雌性大鼠間腦組織內(nèi)BPA及雌二醇處理對(duì)ARC核團(tuán)中Kiss1表達(dá)的抑制作用超過(guò)其對(duì)AVPV核團(tuán)中Kisspeptin表達(dá)的促進(jìn)作用。在BPA處理組中，大鼠間腦組織內(nèi)GnIH mRNA表達(dá)量在BPA低劑量組顯著降低(P＜0.01)，而在BPA高劑量組無(wú)顯著變化。

從BPA對(duì)Kisspeptin mRNA及GnIH mRNA表達(dá)量的影響來(lái)看，高劑量BPA比低劑量BPA對(duì)二者的影響顯著，即BPA的作用具有低劑量效應(yīng)的特點(diǎn)。在內(nèi)分泌擾亂物質(zhì)研究中經(jīng)常出現(xiàn)的倒U型非單調(diào)劑量效應(yīng)關(guān)系(NMDRs)中，低劑量效應(yīng)常常是人們關(guān)注的問(wèn)題。Vandenberg等［1］提出BPA對(duì)機(jī)體的干擾作用具有低劑量效應(yīng)，極低劑量的BPA能夠作用于mER、GPR30以及定位于胞質(zhì)或線粒體上的ERs，刺激一系列“非經(jīng)典”細(xì)胞通路“激活”細(xì)胞應(yīng)答。還有報(bào)道指出，在環(huán)境相關(guān)水平低濃度的BPA對(duì)大鼠可以誘導(dǎo)仔鼠跨代遺傳的表型異常［14］。

綜上所述，BPA能干擾生殖軸中的重要神經(jīng)肽Kisspeptin及GnIH表達(dá)，且其干擾作用具有低劑量效應(yīng)。而低劑量BPA是否作用于GnIH及Kisspeptin神經(jīng)元的特殊類(lèi)型雌激素受體，亦或作用于GnIH及Kisspeptin基因的啟動(dòng)子，影響關(guān)鍵序列的甲基化或乙?；瑥亩斐刹煌诟邉┝緽PA和雌激素的作用，有待進(jìn)一步研究確定。

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