韓忠杰 熊 柳 孫慶杰 劉建輝

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266109)

作為世界及我國的3種主要糧食作物之一的玉米，其年產(chǎn)量已超過1億噸，占糧食產(chǎn)量的22.4%，已超過水稻、小麥，達(dá)到世界糧食中的第一位［1］。

玉米胚芽是玉米生長的根基。玉米胚芽雖然只占籽粒的1/5，但所含有的功能性成分比胚乳更加全面［2］。玉米胚芽蛋白中蛋白質(zhì)主要種類是球蛋白和白蛋白，其含量占總蛋白的3/5以上。玉米胚芽中的蛋白質(zhì)性質(zhì)優(yōu)良，在使用中具有良好的價(jià)值［3－4］。其中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般為23%～25%，其生物效應(yīng)PER值基本上符合世界衛(wèi)生組織∕糧農(nóng)組織的推薦值［5－6］。而國內(nèi)對玉米蛋白的提取主要集中在玉米蛋白，如羅彩鴻［7］等對蛋白質(zhì)提取新工藝的研究，還有林丹丹［8］等對玉米浸泡液中蛋白質(zhì)提純的研究，對玉米胚芽蛋白的制備工藝研究的較少。

為了制備比一般堿溶酸沉法產(chǎn)品色澤風(fēng)味好，功能性質(zhì)高的產(chǎn)品，先用淀粉酶預(yù)處理后采用醇法來制取玉米胚芽蛋白。通過響應(yīng)面分析優(yōu)化了醇法制取玉米胚芽蛋白的生產(chǎn)工藝，提高玉米胚芽蛋白的提取率。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器設(shè)備

玉米胚芽:魯洲生物科技(山東)有限公司提供;α－淀粉酶(3 000 U/g):Sigma公司;6號溶劑:購自天津喜利化工廠;其他試劑均為市售分析純試劑。

Anke TDL－40B型離心機(jī):上海安亭儀器公司;KDN－04凱氏定氮儀:上海貝特儀電設(shè)備廠;DHG－9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;BS224S電子天平、MA45紅外水分測定儀:北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;SX2－8－10馬弗爐:廣州滬瑞明儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 玉米胚芽粉制備方法

經(jīng)粉碎的玉米胚芽過40目篩按照料液比1∶3加入6號溶劑，在40℃下每次浸提4 h后抽濾，反復(fù)浸提、抽濾共6次。第一批料只用6號溶劑浸出，底部流出的“混合溶液”分部收集。按順序浸出下一批料，以此類推。最后一批用新鮮溶劑浸出，新鮮溶劑與玉米胚芽粉之比等于連續(xù)浸出時(shí)的料液比。脫脂后樣品在40℃烘箱進(jìn)行鼓風(fēng)干燥。將干燥后的樣品用高速萬能粉碎機(jī)粉碎，過100目篩備用。

1.2.2 玉米胚芽粉成分的測定

水分的測定:MA45型紅外水分測定儀;蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定:參照GB 5009.5—2010凱氏定氮法《食品中蛋白質(zhì)的測定》;粗脂肪的測定:參照GB/T 5009.6—2003索氏抽提法《食品中脂肪的測定》;灰分的測定:550℃灼燒法，參照GB/T 5505—2008《糧油檢驗(yàn) 灰分測定法》;碳水化合物:碳水化合物=100% －水分－蛋白質(zhì)－脂肪－灰分。

1.2.3 玉米胚芽蛋白制取方法

先用α－淀粉酶進(jìn)行酶解。準(zhǔn)確稱取50 g的脫脂玉米胚芽粉放于燒杯中，按液料比10∶1的比例加入pH 5.2的磷酸緩沖液，沸水浴30 min，之后冷卻至37℃。按照酶添加量3 000 U/g加入α－淀粉酶，37℃下反應(yīng)3 h，離心干燥備用。

采用醇法制取玉米胚芽蛋白粉。準(zhǔn)確稱取50 g已除去淀粉的玉米胚芽粉放于錐形瓶中，按液料比10∶1加入65%的乙醇溶液，放于45℃下封口攪拌，攪拌速度為50 r/min，第1次浸提60 min，抽濾。第2次、第3次均在上述條件下浸提30 min，抽濾。抽濾過后的樣品加入蒸餾水，離心洗滌2次，40℃下鼓風(fēng)干燥。

1.2.4 不同條件下玉米胚芽蛋白粉的制備

1.2.4.1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)條件

分別稱取淀粉酶處理后的玉米胚芽粉50 g放入錐形瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)為45%、55%、65%、75%、85%的乙醇溶液，按照1.2.3的步驟，制備得到不同乙醇體積分?jǐn)?shù)條件的玉米胚芽蛋白樣品。

1.2.4.2 不同液料比條件

分別稱取淀粉酶處理后的玉米胚芽粉50 g放入錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)65%的乙醇溶液，液料比分別為 8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1，按照 1.2.3的步驟，制備得到不同液料比條件的玉米胚芽蛋白樣品。

1.2.4.3 不同浸提時(shí)間條件

分別稱取淀粉酶處理后的玉米胚芽粉50 g放入錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)65%的乙醇溶液，浸提時(shí)間分別為30、60、90、120、150 min，按照 1.2.3 的步驟，制備得到不同時(shí)間條件的玉米胚芽蛋白樣品。

1.2.5 玉米胚芽蛋白提取率的測定［22］

玉米胚芽蛋白提取率計(jì)算:

蛋白質(zhì)提取率=(m1×c1/m0×c0)×100%

式中:m1為玉米胚芽質(zhì)量/g;c1為玉米胚芽的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%;m0為玉米胚芽粉質(zhì)量/g;c0為玉米胚芽粉的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫脂玉米胚芽粉的主要化學(xué)成分

由表1可知脫脂后的玉米胚芽粉蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.65%，主要成分為碳水化質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到了64.57%，所以試驗(yàn)采用了淀粉酶進(jìn)行預(yù)處理。

表1 脫脂玉米胚芽粉的主要化學(xué)成分

2.2 玉米胚芽蛋白粉提取過程中的單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對玉米胚芽蛋白提取率的影響乙醇體積分?jǐn)?shù)對玉米胚芽蛋白提取率的影響見圖1。從圖1可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，蛋白質(zhì)提取率逐漸增高，到達(dá)乙醇體積分?jǐn)?shù)65%時(shí)達(dá)到最高;乙醇體積分?jǐn)?shù)在65%之后，蛋白提取率逐漸降低。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在體積分?jǐn)?shù)為65%左右的乙醇溶液中性質(zhì)不夠穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)容易遭到破壞，易于變性，這時(shí)玉米胚芽粉中蛋白質(zhì)沉淀最大，蛋白質(zhì)提取率最高。但是隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大，在洗去大量呈色、呈味物質(zhì)的同時(shí)，蛋白質(zhì)變性劇烈，造成了蛋白質(zhì)的流失［9］。因此可以先選定一個(gè)浸出效果較好的乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)，也就是體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇溶液，為下面的響應(yīng)面工藝條件做初步的選擇。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對玉米胚芽蛋白提取率的影響

2.2.2 液料比對玉米胚芽蛋白提取率的影響

液料比對玉米胚芽蛋白提取率的影響見圖2。從圖2可以看出，隨著液料比增大，玉米胚芽蛋白提取率逐漸提高，且到達(dá)10∶1時(shí)提取率達(dá)到最高;液料比在10∶1之后，蛋白提取率逐漸降低。液料比在10∶1左右時(shí)，玉米胚芽粉中的呈色、呈味及醇溶性物質(zhì)不斷溶出。但是在液料比大于一定比值時(shí)，所形成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較松散，溶解度升高，溶出較多［10］。這樣就會(huì)造成蛋白質(zhì)流失較為嚴(yán)重，含量有所降低，從而提取率也降低。因此可以初步選擇玉米胚芽蛋白提取率較高的液料比為10∶1。

圖2 液料比對玉米胚芽蛋白提取率的影響

2.2.3 浸提時(shí)間對玉米胚芽蛋白提取率的影響

浸提時(shí)間對玉米胚芽蛋白提取率的影響見圖4。從圖3可以看出在60 min之前，隨著浸提時(shí)間的逐漸延長，蛋白質(zhì)提取率增加，在60 min之后玉米胚芽蛋白提取率雖有所降低，但是變化不大。因?yàn)樘崛r(shí)間在60 min之后，隨著時(shí)間的增加，玉米胚芽蛋白中不只是糖類等物質(zhì)溶解于乙醇，可能某些醇溶性蛋白也逐漸溶于乙醇溶液中。所以在這之后的蛋白含量反而減少，提取率降低，因此浸提時(shí)間不能太長;但若浸提時(shí)間過短，醇溶物質(zhì)溶解不夠完全［11］。綜合考慮，為提高效率，減少資源浪費(fèi)，最大程度的保留蛋白質(zhì)，初步選擇浸提時(shí)間為60 min。

圖3 浸提時(shí)間對玉米胚芽蛋白提取率的影響

2.3 采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化玉米胚芽蛋白粉制取工藝

2.3.1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)中因素和水平的選取

根據(jù)Box－Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合分析單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定制取溫度為45℃，選取對玉米胚芽蛋白的提取率影響較為顯著的3個(gè)因素(乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間)，設(shè)計(jì)了3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的水平及編碼表見表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的水平及編碼表

2.3.2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2.1 方差分析、回歸方程及期望參數(shù)分析

以X1(乙醇體積分?jǐn)?shù))、X2(液料比)、X3(浸提時(shí)間)為自變量，以玉米胚芽蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)分析，響應(yīng)面試驗(yàn)安排與結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)安排與結(jié)果

采用Design Expert8.0.5b軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到玉米胚芽蛋白質(zhì)提取率的回歸方程為:

Y1=42.11 － 0.49X1+1.44X2+0.873X3－1.17X1X2－ 1.27X1X3－ 0.33X2X3－ 3.59X1X1－3.06X2X2－3.17X3X3

通過比較回歸方程一次項(xiàng)系數(shù)絕對值的大小，可以判斷影響玉米胚芽蛋白粉蛋白提取率的主要因素依次是:料液比＞時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。

對回歸方程做顯著性檢驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果分析見表4。F回歸=96.37，P ＜0.000 1 表明模型極顯著，玉米胚芽蛋白粉蛋白濃度與各因素(乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、浸提時(shí)間)之間存在顯著性。其中X2、X3、X1X2、X1X3、X12、X22、X327項(xiàng)P＜0.01，它們對響應(yīng)值Y的影響極顯著，其余項(xiàng)對Y不構(gòu)成顯著影響。失擬項(xiàng)(反映的是試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型不相符的情況)的F值為15.41，與整個(gè)模型的96.37相比是很小的，這說明不符合的數(shù)據(jù)相對純誤差是不顯著的，因此未知因素對試驗(yàn)結(jié)果干擾很小。相關(guān)系數(shù)R2(因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系)為0.992 0，表明響應(yīng)值(提取率)的變化有99.20%來源于所選變量，即乙醇濃度、液料比和浸提時(shí)間。因此，該回歸方程對試驗(yàn)擬合情況較好，能夠解釋絕大多數(shù)因變量變化。

表4 回歸模型方差分析表

2.3.2.2 交互作用分析

乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比對玉米胚芽蛋白提取率的影響見圖4。由圖4可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%～65%時(shí)，玉米胚芽蛋白粉的蛋白提取率不斷增加，之后隨著乙醇濃度的增加，玉米胚芽蛋白提取率有下降的趨勢。液料比為9∶1～10∶1的范圍內(nèi)蛋白提取率不斷增加，之后隨著液料比的增加，玉米胚芽蛋白提取率緩慢降低。等高線的形狀可以反映出兩個(gè)因素交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則表示交互作用不顯著［12］。從圖4b可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比兩個(gè)因素的交互作用顯著。上述結(jié)果表明在較低乙醇體積分?jǐn)?shù)下，適當(dāng)提高液料比有助于玉米胚芽蛋白提取率的提高。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比及其交互作用

乙醇體積分?jǐn)?shù)和浸提時(shí)間對玉米胚芽蛋白提取率的影響見圖5。由圖5可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%～65%和浸提時(shí)間為0.5～1.0 h的范圍內(nèi)，玉米胚芽蛋白提取率不斷增加，之后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和浸提時(shí)間的增加，玉米胚芽蛋白提取率呈現(xiàn)下降的趨勢。從圖5b可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)和時(shí)間兩個(gè)因素之問的交互作用顯著。上述結(jié)果表明在較低乙醇體積分?jǐn)?shù)下，適當(dāng)延長浸提時(shí)間有助于玉米胚芽蛋白提取率的提高。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)和浸提時(shí)間及其交互作用

液料比和浸提時(shí)間對玉米胚芽蛋白提取率的影響見圖6。從圖6中可以看出，當(dāng)液料比在低水平范圍內(nèi)取值時(shí)，玉米胚芽蛋白的蛋白提取率隨著處理時(shí)間的增加先快速升高而后呈現(xiàn)降低的趨勢。料液比較高時(shí)，玉米胚芽蛋白粉的蛋白提取率隨著浸提時(shí)間的增加變化不明顯。從圖6b可以看出，液料比和浸提時(shí)間兩個(gè)因素之間的交互作用顯著。上述結(jié)果表明在較低液料比下，適當(dāng)延長浸提時(shí)間有助于玉米胚芽蛋白粉的蛋白提取率的提高。

圖6 液料比和浸提時(shí)間及其交互作用

由圖4～圖6得出玉米胚芽蛋白的最佳提取條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)為63.67%，液料比為10.25∶1(mL∶g)，溫度為45℃，提取時(shí)間為1.06 h。在該提取條件下，蛋白質(zhì)提取率可達(dá)82.37%。在乙醇體積分?jǐn)?shù)63%，液料比為10∶1，溫度45℃，提取時(shí)間為1 h時(shí)，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的玉米胚芽蛋白的蛋白提取率為81.87%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)55.73%，與計(jì)算機(jī)模擬值基本接近，表明預(yù)測值和真實(shí)值之間有很好的擬合性，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的可靠性。

3 結(jié)論

3.1 通過單因素得出玉米胚芽蛋白的最佳提取條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，液料比為10∶1(mL∶g)，溫度為45℃，提取時(shí)間為1 h。

3.2 響應(yīng)面分析結(jié)果的表明:影響玉米胚芽蛋白提取率的主要因素依次是:液料比＞時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。玉米胚芽蛋白的最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)為63.67%，液料比為10.25∶1(mL∶g)，溫度為 45℃，提取時(shí)間為1.06 h，蛋白質(zhì)提取率可達(dá)82.37%。進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的玉米胚芽蛋白的蛋白提取率為81.87%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)55.73%。

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