王 勇，李水明，何曼文

（1.深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東 深圳 518060；2.深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市微生物基因工程重點實驗室，廣東 深圳 518060）

質(zhì)譜技術(shù)目前已成為研究蛋白質(zhì)和其它生物分子的核心分析技術(shù)［1－5］。蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的一個關(guān)鍵問題是實驗的可重復(fù)性，因此，前人在利用鳥槍法質(zhì)譜平臺進行肽段檢測時，針對肽段鑒定的隨機性和可預(yù)測性方面已開展較多工作［6］。值得注意的是，即使對于純化的蛋白標準品或表達蛋白，仍很難有100%的鑒定覆蓋率［7］，這一現(xiàn)象除了與樣品用量、實驗操作和儀器靈敏度等有關(guān)外，還與數(shù)據(jù)解析相關(guān)［8］。目前應(yīng)用最多的是針對串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫搜索算法，盡管這種方法的通量和可靠性可以滿足生物學(xué)研究需要，并且在不斷提高，但如果對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行仔細分析和進一步實驗驗證，則有可能提高覆蓋率，獲得更多的結(jié)構(gòu)信息。

硒 結(jié) 合 蛋 白 （selenium－binding protein，SBP）是一種特殊的含硒蛋白，因能結(jié)合硒而命名［9－13］。目前，硒結(jié)合蛋白的研究大多集中在模式生物，如人、鼠和擬南芥等［14］，而對非模式生物研究較少。本工作前期克隆測序了白鰭鯊SBP基因，現(xiàn)利用基質(zhì)輔助激光解吸電離－串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（MALDI－TOF／TOF）鑒定原核表達的鯊魚硒結(jié)合蛋白，確定表達是否成功，同時討論影響蛋白鑒定覆蓋率的實驗因素。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

4800MALDI TOF／TOF Analyzer基質(zhì)輔助激光解吸電離－串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀：美國AB Sciex公司產(chǎn)品；Milli－Q超純水處理系統(tǒng)：美國Millipore公司產(chǎn)品；胰蛋白酶（質(zhì)譜分析級）：Promega公司產(chǎn)品；α－腈基－4－羥基肉桂酸：美國Sigma公司產(chǎn)品，使用前重結(jié)晶。

1.2 樣品的還原、烷基化和酶解

經(jīng)一維聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后的目標條帶脫色干燥后，用二巰基乙醇和碘乙酰胺烷基化30min，加入5μL 20mg／L質(zhì)譜用測序級胰蛋白酶，4 ℃放置30min，再加入5μL 40 mmol／L NH4HCO3－10% 乙腈，37℃水浴8h。

1.3 質(zhì)譜和數(shù)據(jù)分析條件

基質(zhì)制備：將6g／Lα－腈基－4－羥基肉桂酸和2g／L檸檬酸氫二銨溶于10mL 50%乙腈（含0.1%三氟乙酸）中，基質(zhì)溶液與蛋白酶解液按1∶1混合后，點于不銹鋼靶板。采用正離子反射模式，一級質(zhì)譜每張譜圖累加800次，二級質(zhì)譜累加1 200次，碰撞誘導(dǎo)解離條件為1kV碰撞能加空氣碰撞。

數(shù)據(jù)庫搜索條件：串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜庫，信噪比設(shè)為5，子離子和母離子質(zhì)量誤差均設(shè)為0.3 u，Mascot軟件分析，搜索數(shù)據(jù)庫NCBI于2012年8月發(fā)布，甲硫氨酸氧化（oxidation）和半胱氨酸烷基化（carbamidomethyl）作為可變修飾，胰酶漏切位點數(shù)1。

2 結(jié)果與討論

2.1 數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果

白鰭鯊硒結(jié)合蛋白的編碼區(qū)基因序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫（gi｜350626507），Mascot得分為1 121分（肽段離子得分大于53為結(jié)果可信），說明原核表達成功，鑒定結(jié)果可證明確為該蛋白，其搜庫結(jié)果示于圖1。與其結(jié)構(gòu)最為類似的是斑馬魚SBP，但只匹配了3個肽段，得分為237分。值得注意的是，m／z2 335.06離子的串聯(lián)質(zhì)譜也可以匹配為肽段FLHNPAATE（Methyl）GMVGCALGSSVFR（96分），但因得分相對較低，并經(jīng)人工比對確認為半胱氨酸的丙酰胺化（141分）。在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，一般認為存在3個高置信度肽段即可認為鑒定了一個蛋白，但對于一個分子質(zhì)量為52ku的原核表達蛋白鑒定而言，串聯(lián)質(zhì)譜只以35%的覆蓋率鑒定12個肽段，詳情列于表1。因此，本工作進一步探究了影響鑒定覆蓋率的原因。

圖1 白鰭鯊硒結(jié)合蛋白的Mascot搜庫結(jié)果Fig.1 The database searching result of selenium－binding protein of whitetip reef shark

表1 白鰭鯊硒結(jié)合蛋白1的搜庫鑒定結(jié)果Table 1 Peptides of selenium－binding protein 1identified by database searching

2.2 提高SBP鑒定覆蓋率的研究

首先，分析了SBP胰酶水解液的一級譜圖，發(fā)現(xiàn)除了m／z2 211.093離子外，其余的高豐度離子均被選擇進行串聯(lián)質(zhì)譜分析并被匹配，說明蛋白分離較純，其它雜質(zhì)蛋白不干擾分析。由于在胰蛋白酶自切峰表中包含m／z2 211.105離子，所以常規(guī)條件下，m／z2 211.093因分子質(zhì)量相近而未被選擇進行串聯(lián)質(zhì)譜分析，但由于未觀察到其它胰酶自身酶解肽段，并且經(jīng)MS－digest軟件分析發(fā)現(xiàn)，SBP也可產(chǎn)生質(zhì)荷比為2 211.119的肽段，因此對該離子進行串聯(lián)質(zhì)譜分析，其質(zhì)譜圖示于圖2。由圖2發(fā)現(xiàn)，該肽段不是胰酶自切峰，而確為鯊魚SBP的肽段NFLVDFGKEPDGPALAHEVR，該肽段中賴氨酸殘基因與谷氨酸相鄰而漏切［15］。由于只有在目標蛋白濃度較低時才可以檢測到明顯的胰酶自切峰，該結(jié)果提示在蛋白濃度較高時可不排除它們，以保證測定的完全。

圖2 m／z 2 211.093離子的串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜圖Fig.2 MALDI－TOF／TOF spectrum of m／z 2 211.093

其次，目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中多采用數(shù)據(jù)依賴型采集模式，即根據(jù)前體離子在一級譜中的豐度高低，決定是否選擇其進行下一級分析［16］，因此，一級譜中的很多低豐度離子未被選擇，它們可能是噪音或其它蛋白質(zhì)的污染，也可能是目標肽段，這可對所有可能的目標肽段離子進行串聯(lián)質(zhì)譜分析。例如，m／z833.39離子在一級譜中的相對強度只有1.35%，串聯(lián)質(zhì)譜的絕對強度小于500，但串聯(lián)質(zhì)譜幾乎連續(xù)的y離子和豐富的a、b系列離子證明其為肽段GGDWAAEK，數(shù)據(jù)質(zhì)量很好，可以用于從頭測序，其質(zhì)譜圖示于圖3，其中m／z159.08為色氨酸的亞胺離子。

圖3 m／z 833.40離子的串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜圖Fig.3 MALDI－TOF／TOF spectrum of m／z 833.40

由于串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜的離子選擇能力至少為3u，因此即使是對同一蛋白也可能產(chǎn)生混合譜［17］。m／z1 440.69離子的串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜圖示于圖4，在圖4中觀察到了完整的y序列離子和部分b離子，搜庫鑒定為肽段EEIVYVPC（Carbamidomethyl）IYR（理 論m／z1 440.719 2），但仔細比對發(fā)現(xiàn)還存在另一肽段MVGQVFIGGC（Carbamidomethyl）FVK（理論m／z1 441.733 0），主 要 觀 察 到 了 該 肽 段 的y6＊～y9＊離子和甲硫氨酸及苯丙氨酸的特征亞胺離子，提示圖4為這兩個肽段組成的混合譜。最后，也有低豐度前體離子質(zhì)量與酶解肽段的理論值接近但串聯(lián)質(zhì)譜不符的現(xiàn)象，說明單一利用肽指紋譜鑒定蛋白有可能產(chǎn)生肽段鑒定的假陽性。將串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)歸納整理后，發(fā)現(xiàn)鑒定肽段數(shù)明顯增多，共檢測出5個新肽段，162個氨基酸殘基，鑒定覆蓋率從原來的35%增加至51%，示于圖5。這些新確定的肽段多以賴氨酸殘基結(jié)尾（圖5中劃線部分），這與梁宋平等［18］報道的在MALDI電離條件下賴氨酸結(jié)尾肽段靈敏度低于精氨酸結(jié)尾肽段的結(jié)論一致。

圖4 m／z 1 440.69離子的串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜圖Fig.4 MALDI－TOF／TOF spectrum of m／z 1 440.69

圖5 白鰭鯊硒結(jié)合蛋白序列及所測肽段（加粗表示搜庫結(jié)果）Fig.5 Protein sequence of selenium－binding protein of whitetip reef shark（Bold font means the database search result）

3 結(jié)論

本研究鑒定了原核表達的鯊魚硒結(jié)合蛋白，對未匹配數(shù)據(jù)的分析表明：對一級質(zhì)譜中的弱信號進行串聯(lián)質(zhì)譜分析亦可獲得高置信度的序列信息，同時發(fā)現(xiàn)該目標蛋白含有與胰酶自切峰分子質(zhì)量相近的肽段。通過人工解析提高了肽段鑒定的可信度和蛋白鑒定覆蓋率，但覆蓋率的進一步提高則需進行液相色譜分離。該結(jié)論對目前基于雙向電泳分離的蛋白質(zhì)鑒定和翻譯后修飾研究具有參考作用。此外，在蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定中，由于實驗操作或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特異性而引起的胰蛋白酶漏切或不常見翻譯后修飾也是影響質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用率的因素［19－20］。

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